1

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge., Lamiaceae) là dược liệu được dùng để
chữa một số bệnh như cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, đau thắt ngực, rối loạn
kinh nguyệt…Hiện nay nhu cầu trong nước và thế giới về cao Đan sâm là rất
lớn. Một số công ty dược phẩm trong nước hiện đã sản xuất cao Đan sâm.
Tuy nhiên, việc chiết xuất các cao này vẫn chưa đáp ứng yêu cầu sản xuất tại
các nhà máy đạt GMP vì quy trình chiết xuất chưa được tối ưu hóa nên hiệu
suất chiết chưa cao, chất lượng cao Đan sâm còn thấp, không ổn định. Do đó,
tác dụng điều trị không đảm bảo vì chứa ít hoặc không có các hoạt chất.

Chiết xuất dược liệu là một quá trình dùng dung môi để chiết tách một hoặc
nhiều hoạt chất có tác động sinh học từ pha rắn là các bộ phận của dược liệu
có thể là thân, rễ, quả, lá, hoa… Mối liên quan giữa các điểu kiện chiết xuất
(dược liệu, dung môi và kỹ thuật) với kết quả chiết xuất (hiệu suất, tỷ lệ hoạt
chất, tỷ lệ tạp chất…) được gọi là mối liên quan giữa nhân và quả. Bằng con
đường dò dẫm theo kinh nghiệm, nhà chiết xuất khó lòng xác định các mối
liên quan ấy một cách định lượng nên có thể khảo sát yếu tố thứ yếu mà bo
qua yếu tố trọng yếu, tốn thì giờ mà không tìm ra các thông số phù hợp.
Ngày nay, việc xây dựng một quy trình chiết xuất dược liệu có thể được thực
hiện một cách khoa học bằng cách kết hợp phương pháp thực nghiệm truyền
thống với sự hỗ trợ của bộ ba phần mềm gồm: a). Phần mềm thống kê: thiết
kế mô hình thí nghiệm để định hướng cho thực nghiệm chiết xuất. b). Phần
mềm thông minh sử dụng công nghệ thần kinh-logic mờ có thể phân tích: xu


2

hướng, mức độ và quy luật liên quan giữa điểu kiện chiết xuất và kết quả

màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông
nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá chét thành múi nho. Cụm
hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu ngọn thành bông gồm nhiều vòng sít nhau ở ngọn,
mỗi vòng có 3-10 hoa màu lơ tím nhạt; đài chia 2 môi, môi trên dài hơn ống


4

tràng và cong hình lưỡi liềm, môi dưới chia 2; nhị 3. Quả bế nho, đầu tù, dài
3 mm. Mùa hoa: tháng 5-8; mùa quả : tháng 6-9. [3,4]

Sơ đồ 2.1. Phân loại thực vật Đan sâm


5

2.1.2. Phân bố và bộ phận dùng
Phân bố
Salvia L. là một chi lớn trong họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới
ấm và cận nhiệt đới, chỉ có ít loài ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam có 4-5 loài,
trong đó Đan sâm là cây nhập nội. Cây Đan sâm trồng ở nước ta có xuất xứ từ
Trung Quốc. Cây trồng ở trại thuốc Sa Pa (Viện Dược liệu) to ra thích nghi
với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh trưởng phát triển tương
đối tốt; ra hoa quả hàng năm; hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiều
năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng
kém hơn. Đam sâm chưa được đưa vào sản xuất. Những cây còn lại ở Sa Pa
chỉ có ý nghĩa để giữ giống. [2,3,4,12]
Bộ phận dùng

Hình 2.1. Toàn cây Đan sâm

salvianic, các acid salvianolic A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, acid lithospermic,
ethyl lithospermat, ethyl lithospermat B, acid prolithospermic, danshensu,
salviaflasid, salvinal...). Dẫn xuất của chúng được chia thành 4 nhóm chính
dựa trên số đơn phân acid caffeic. [14]
− Acid caffeic monomer: nhóm này bao gồm acid isoferulic, acid caffeic,
danshensu và 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-lactamid.
− Acid caffeic dimer: gồm acid rosmarinic, methyl rosmarinate, acid
salvianic C, acid salvianolic D, acid salvianolic F, acid prolithospermic,
acid salvianolic G.
− Acid caffeic trimer: gồm acid salvianolic A, acid lithospermic, methyl
lithospermat, dimethyl lithospermat, acid salvianolic C, acid salvianolic J,
acid salvianolic I.
− Acid caffeic tetramer: nhóm này cũng có thể coi như là dẫn chất dimer của
acid rosmarinic, gồm acid salvianolic E, acid salvianolic B, ethyl
lithospermat, magie lithospermat B và kali-amoni lithospermat B.
Các nhóm hợp chất khác
Ngoài các nhóm hợp chất chính có tác dụng sinh học, trong Đan sâm còn
chứa nhiều hợp chất cao phân tử như các polysaccharid (tinh bột, đường...),
lignan, các polypeptid, protein.... Các hợp chất này dễ tan trong nước và sẽ
được lôi kéo theo trong quá trình chiết xuất cao nên được gọi là các chất


8

không mong muốn cần hạn chế trong quá trình chiết xuất. [25]
Bảng 2.1. Các hợp chất phân lập từ Salvia miltiorrhiza Bunge
Hợp chất phân cực

Hợp chất kém phân cực


Dihydroisotanshinon I

Protocatechualdehyd

Neocryptotanshinon

Acid isoferulic

Deoxyneocryptotanshinon

Baicalin

Salviol

Isomperatorin

Nortanshinon

Acid ursolic

Tanshindiol A,B,C

Bêta - sistosterol

Miltiron

Daucosterol

1-dehydromiltiron


O

O

O

tanshinon I

dihydro-tanshinon I

1,2-dihydro-tanshinon I

= tanshiquinon

= dihydrotanshiquinon

= 1,2-dihydrotanshiquinon

O

O

O
O

O

O

*

O

O

O

tanshinon IIA

dihydro-tanshinon IIA

O

O

O

O

1-hydroxy-tanshinon IIA
O

O
O

O
O

OH

O

O

HO
OH

HO

O

OH
OH


10

Acid salvianolic A

Acid salvianolic C
OH
OH

O
O
CO2H O

HO

COOH

CO2H


O

O
HOOC
HO

O
O

HO

OH

Acid salvianolic B
Hình 2.4. Một số công thức hóa học của nhóm polyphenol.

2.1.4. Tác dụng dược lí
Hoạt tính chống ung thư


11

Tanshinon IIA phân lập từ Đan sâm được chứng minh có độc tính trên tế bào
ung thư ở người, là chất có tiềm năng trong điều trị ung thư máu. Cơ chế được
cho là tanshinon IIA có vai trò trong ức chế con đường tăng sinh của tế bào.
Thêm vào đó, tanshinon IIA cũng gây ra sự chết hàng loạt của tế bào ung thư
gan Hep G2. [26]
Hoạt tính chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong Đan sâm dựa trên 3 cơ chế là

bảo vệ thận. Khi bị thiếu máu cục bộ, do suy giảm ATP, các chất dẫn truyền
thần kinh như norepinephrin tăng lên gây tổn hại cho não bằng cách oxy hóa
để sản xuất các gốc oxy hoặc các cơ chế khác. Đan sâm được chứng minh là
có thể giảm việc giải phóng của norepinephrin, dopamin và serotonin trong
não thiếu máu cục bộ do tác dụng ức chế men chuyển [2,3,14,26].
Tác dụng hạ huyết áp
Đan sâm được chứng minh là có tác dụng ức chế men chuyển (tác dụng lên
angiotensin II) gây hạ huyết áp, giãn động mạch và giảm đông máu. Một
nghiên cứu khác đã xác định tác dụng hạ huyết áp của Đan sâm có thể là do
giãn động mạch vành. Uống magie lithospermat B có tác dụng hạ huyết áp
tâm trương và tâm thu trên chuột. Tác dụng này là do magiesium tanshinoat B
kích thích giải phóng oxid nitric (NO) và các chất chuyển hóa của nó, oxid
nitric là một chất giãn mạch mạnh và đóng vai trò trong việc điều hòa trương


13

lực thành mạch. Acid prolithospermic cũng có thể gây ra sự giãn mạch động
mạch chủ chậm nhưng kéo dài trên chuột [2,26].
Tác dụng chống kết tập tiểu cầu
Tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu được giải thích là do tác dụng ức chế men
chuyển và tác dụng lên receptor α2β1. Acid salvianolic B có tác dụng chống
kết tập tiểu cầu do tác dụng lên receptor α2β1. Tác dụng trên receptor α2β1 của
acid salvianolic B có đặc điểm là chỉ tác dụng lên collagen chứ không tác
dụng lên fibrinogen. Acid acetylsalvianolic A là một dẫn xuất bán tổng hợp từ
các acid salvianolic cũng có tác dụng chống kết tập tiểu cầu. Acid rosmarinic
và các acid salvianolic có tác dụng ức chế thomboxan B2, ngăn sự kết tập lại
của các tiểu cầu [2,26].
Tác dụng khác
Acid rosmarinic, lithospermic và dẫn xuất methyl ester của những chất này ức

hoàng 10 g, Nước 600 ml. Sắc còn 200 ml, chia làm 3 lần uống trong ngày
[8].
Chế phẩm chứa Đan sâm trên thị trường
Đan sâm tam thất

(Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan

(Công ty dược phẩm Á Âu)


15

Ích thận vương

(Công ty dược phẩm Á Âu)

Phụ lạc cao

(Công ty dược phẩm Á Âu)

Đan sâm - Tam thất
(Công ty cổ phần dược phẩm Domesco)

Thiên sứ hộ tâm đan
(Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu)

Phụ lạc cao
(Công ty cổ phần dược phẩm Á Âu)

nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Khả năng hòa tan các chất


17

trong dung môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của
chất tan và dung môi. Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế
bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra dễ dàng, quá trình chiết
xảy ra càng nhanh [10,11]
Kỹ thuật chiết
Chênh lệch nồng độ càng lớn, tốc độ khuếch tán càng cao. Việc tăng lượng
dung môi làm tăng sự chênh lệch nồng độ nên quá trình chiết xảy ra nhanh
hơn. Sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên
ngoài các tiểu phân dược liệu bằng phương pháp cơ học. Sự chênh lệch nồng
độ giữa trong và ngoài tế bào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanh
hơn. Tăng nhiệt độ làm tăng khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi và
đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử.
Giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hòa tan, tăng quá
trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ. Sự tăng áp suất làm tăng tốc độ thấm
dung môi vào nguyên liệu [11]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
được minh họa ở Sơ đồ 2.2.

2.2.2. Các phương pháp chiết xuất
Tùy mục đích sử dụng dịch chiết, căn cứ vào khả năng hòa tan của những chất
trong dược liệu vào dung môi và bản chất dược liệu mà tiến hành chiết xuất
theo một hoặc kết hợp các phương pháp sau: [11]
Phương pháp ngấm kiệt
Phương pháp chiết xuất lấy kiệt hoạt chất trong dược liệu bằng cách cho dung
môi thấm qua lớp dược liệu đã xay nho với kích thước thích hợp.


Thời gian

Áp suất

Sản phẩm
Chất phụ gia
pH

Tỷ lệ dược liệu/dung môi

Nồng độ dung môi
Loại dung môi

Dung môi

Sơ đồ 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu.

Ngấm kiệt cổ điển
Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo
một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình ngấm kiệt được


19

thực hiện trong bình chiết gọi là bình ngấm kiệt: hình dạng, cấu tạo và kích
thước của bình có thể thay đổi tùy theo mục đích sử dụng nhưng thường phần
thân chính của bình có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu
lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu.
Ngấm kiệt cải tiến
Ngấm kiệt ngược dòng: thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết kết hợp

trình chiết xuất dược liệu...
Mô hình yếu tố đầy đủ (full factorial design) có ưu điểm là cho phép khảo sát
ảnh hưởng của các yếu tố cũng như tương tác của chúng. Tuy nhiên mô hình
yếu tố đầy đủ đòi hoi phải có một số lượng thí nghiệm rất lớn khi số yếu tố
tăng lên. Mô hình yếu tố giản lược (fractional factorial design) cho phép giảm
bớt rất nhiều số thí nghiệm mà vẫn khảo sát được một số sự ảnh hưởng của
các yếu tố. Thí dụ: D-Optimal, Taguchi OA... Khi thiết kế mô hình thí
nghiệm, nhà phân tích nên chọn các biến độc lập và biến phụ thuộc đã được
thăm dò là có mối liên quan nhân quả. Mô hình thực nghiệm có thể được thiết
kế bởi phần mềm thống kê, thí dụ: FormData [19].
Phân tích liên quan nhân quả


21

Mối liên quan là sự tương ứng (correspondence) giữa hai biến số x và y.
Trường hợp đơn giản trong toán thống kê gọi là tương quan (correlation),
Trường hợp phức tạp gọi là mối liên quan nhân-quả (cause-effect
relationship). Ngày nay, trong phân tích dữ liệu có một lãnh vực mới, đó là
khám phá tri thức (knowledge discovery) hay khai thác dữ liệu (data mining).
Công nghệ thông minh có tên là logic mờ - thần kinh (neurofuzzy logic), thí
dụ: phần mềm thông minh FormRules [20], có thế mạnh về lãnh vực này. Từ
dữ liệu thực nghiệm theo mô hình thiết kế, mối liên quan nhân quả có thể
được phân tích qua các mặt: xu hướng, mức độ và quy luật liên quan.
Tối ưu hóa nhiều biến phụ thuộc
Tối ưu hóa là sự ước tính các biến độc lập (x 1, x2...) sao cho biến phụ thuộc
(y1, y2...) được tối đa hoặc tối thiểu. Trong thành lập công thức chế phẩm, chiết
xuất dược liệu, sắc ký long hiệu năng cao... nhiều khi phải có sự dung hòa để
cho nhiều giá trị y1, y2... đạt được tối ưu (optimal) thay vì một biến (y) tối
thiểu (minimum) hoặc tối đa (maximum). Đây là khái niệm tối ưu hóa nhiều

(nhiều biến số phụ thuộc cùng một lúc). Gần đây, ở Việt nam, có một số đề tài
kết hợp phương pháp truyền thống với bộ 3 phần mềm nghiên cứu-phát triển
trong bào chế [9,13] và chiết xuất dược liệu [5,7,15].

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP


23

3.1. Dược liệu, dung môi và trang thiết bị
Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn, hóa chất và dung môi, thiết bị chiết
xuất, thiết bị kiểm nghiệm, phần mềm thống kê và phần mềm thông minh lần
lượt được được trình bày trong các Bảng 3.1., Bảng 3.2., Bảng 3.3., Bảng 3.4.
và Bảng 3.5.
Bảng 3.1. Danh sách nguyên liệu và chất chuẩn
STT

Nguyên liệu và chất chuẩn

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

1

Rễ Đan sâm

Tiêu chuẩn cơ sở

Công ty Dược phẩm


Nguồn gốc

Công nghiệp

Công ty hóa chất
Hóa Nam.


24

2

Acetonitril

HPLC

Merk

3

Methanol

PA

Trung Quốc

4

Cloroform


Benzen

PA

Trung Quốc

9

Toluen

PA

Trung Quốc

10

Acid formic

PA

Trung Quốc

Nhãn hiệu

Nguồn gốc

Kottermann

Đức

3

Máy cô quay chân không

Bảng 3.4. Danh sách thiết bị kiểm nghiệm
STT
1

Thiết bị kiểm nghiệm
Cân điện tử 4 số


25

AEX – 120G
2

Cân điện tử 5 số

3

Máy HPLC

4

Lò nung

5

Máy soi UV 2 bước sóng

GallenKamp

Anh

Merck

Đức

Bảng 3.5. Danh sách phần mềm thống kê và phần mềm thông minh
STT

Tên phần mềm

Nhãn hiệu

Nguồn gốc

Thiết kế thí nghiệm

Intelligensys Ltd.,UK

1

FormData v3 (2010)

2

FormRules V3.3
(2007)