ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN
NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------------------

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU
KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN NĂNG
SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM ĐÔNG
TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Ngành
Công nghệ sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài. .......................................................................................... 1
2 Mục đích nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo.............................................................. 4
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo .................................................................... 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ........................................ 6
1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.................................. 7
1.2.1 Giá trị dược liệu ....................................................................................... 7
1.2.2. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................. 11
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris ......................................................................................... 13
1.3.1. Vai trò của giống. .................................................................................. 13
1.3.2. Yếu tố dinh dưỡng................................................................................. 14
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể
nhân tạo thể rắn ............................................................................................... 15
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...............................................
16
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 16
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trên Thế gới ....................................................... 19


3

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 21


3.5. Ảnh hưởng của muối đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình
thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh
học.................................................. 46
3.6 Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng đến sự
hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường
nhân tạo.
......................................................................................................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
4.1 Kết luận ..................................................................................................... 53
4.2 Đề nghị ...................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55


5

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BE

:

Biological efficiency

ĐC

:

Đối chứng



6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nấm ĐTHT Cordyceps militaris .............. 12
Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.......................................................... 21
Bảng 3.1: So sánh về tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên môi trường nhân
giống cấp I. ...................................................................................................... 33
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đến sự phát triển của hệ
sợi nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 34
Bảng 3.3: bảng tổng hợp đánh giá khả năng thích nghi của hệ sợi nấm trên các
loại cơ chất giá thể khác nhau. ........................................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo đến sự hình
thành và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh
học........................................ 36
Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn carbon tới năng suất nuôi
trồng nấm Đông trùng hạ thảo ........................................................................ 40
Bảng 3.6: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn carbon tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 41
Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn ni to khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo......................................................... 44
Bảng 3.8: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 45
Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới năng
suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo
................................................................ 48
Bảng 3.10: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới hàm lượng
Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT ................................................................. 49
Bảng 3.11: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng
50

nấm Đông trùng hạ thảo .................................................................................. 43
Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ khác nhau tới năng suất nuôi trồng
nấm .................................................................................................................. 44
Hình 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng đến
khả năng sinh trưởng của sợi nấm
......................................................................... 46
Hình 3.11. Ảnh hưởng của muối khoáng tới sinh trưởng và phát triển của quả
thể nấm Đông trùng hạ thảo ............................................................................ 47


vii
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các muối khoáng khác nhau tới năng suất nuôi
trồng nấm
.................................................................................................................. 49


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung chỉ những loài nấm thuộc lớp
Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes. Tên gọi
của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm
xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể
nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực
vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo.
Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước phát
triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của đông trùng hạ thảo. C.
militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể:
Cordycepin có tác dụng ức chế sự phân hạch và trì hoãn sự lây lan của các tế

trên quả thể của nấm có chứa nhiều các hoạt tính sinh học hơn trong các sợi
nấm.
Tại Việt Nam, cho đến nay mặc dù đã có nhiều cơ sở và đơn vị nhân
nuôi thành công nấm Đông trùng hạ thảo, tuy nhiên nuôi trồng Đông trùng hạ
thảo trên môi trường nhân tạo gặp phải những khó khăn: Nấm C.militaris có
tính thoái hóa cao nên việc sản xuất nấm không ổn định, hoặc ở một vài nơi
mặc dù nuôi trồng thành công nhưng hàm lượng hoạt chất sinh học không
cao. Xuất phát từ những quan điểm đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến năng suất, chất
lượng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”.
2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá được ảnh hưởng môi trường nhân giống và các điều kiện
dinh dưỡng tới khả năng sinh tổng hợp Cordycepine của nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris trên môi trường giá thể thể rắn.


3. Mục tiêu nghiên cứu

- Tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng tới năng suất và hàm lượng
hoạt chất Cordycepine ở nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo
1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo
Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng
những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh
phấn thuộc chi Thitarodes. Tên gọi chúng xuất phát từ quan sát thực tế: vào

đảm bảo sự phát tán bào tử một cách tối đa. Sau đó các bào tử bắt đầu hình
thành hệ sợi, hê sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ gây chết ký
chủ. Khi thời tiết ấm áp hơn,


hệ sợi nấm bắt đầu phát triển một cách mạnh mẽ hình thành quả thể và chồi
lên khỏi mặt đất và tiếp tục vòng sinh sản mới nhờ phát tán bào tử.

Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo
1.1.4. Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
Trong cây phân loại loài, Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được
xem là loài có đặc điểm tiến hóa nhất chi Cordyceps do có phổ kí chủ rộng.
Chúng có thể kí sinh trên cả sâu non, nhộng hoặc cá thể trưởng thành của một
số loại côn trùng. Cordyceps militaris là một loài sinh sản vô tính, sau khi
phát triển thành thục có thể hình thành các nang bào tử; bên trong các nang
bào tử là tập hợp các bào tử đơn và phát tán vào trong không khí. Các bào tử
này trong điều kiện thích hợp sẽ nảy chồi tạo thành các sợi nấm sơ cấp. Các
sợi nấm sơ cấp một mặt không ngừng phát triển để tạo hệ sợi thứ cấp, một mặt
tiếp tục xâm nhập vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ
thể côn trùng. Kết thúc giai đoạn sinh trưởng, các hệ sợi thứ cấp được liên kết
với nhau tạo thành một khối thồng nhất gọi là quả thể nấm. Quả thể nấm có
màu vàng cam hoặc cam hồng dài khoảng từ 2 – 8 cm. Quả thể nấm tiếp tục
phát triển đến giai đoạn thành thục và phát tán bào tử bắt đầu chu kì sinh
trưởng và phát triển mới.


So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng dễ hơn trong
môi trường nhân tạo. Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như
là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh học
và tính chất dược liệu tương tự nhau. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã

guanine, guanosine, uracil, uridine, hypoxanthine, inosine, thymine,
thymidine,
2` deoxyuridine, 2`-deoxyadenosine, cordycepin N6-methyladenosine, và 6hydroxyethyl-adenosine) đã được xác định và tách chiết (Chang ST and
Wasser SP 2012).
Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị dược liệu
Cordycepin (3'-deoxyadenosine)
Cordycepin là thành phần hoạt chất chính có trong quả thể Cordyceps
militaris, được phát hiện lần đầu tiên từ Cordyceps militaris và sau đó tìm
thấy có mặt trong Cordyceps sinensis (Cunningham, Manson et al. 1950)
và Cordyceps kyushuensis (Ling JY, Sun YJ et al. 2002).
Theo Khan và cộng sự (2010), Cordycepine trong ĐTHT có khả năng ức
chế sự phát triển của khối U, tăng thời gian sống cho những con chuột được
cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự di căn của tế bào ung thư
(Asaduzzaman Khan, Mousumi Tania et al. 2010). Dịch chiết từ nấm ĐTHT
ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn (HUVEC), dòng tế bào mô
mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT180. Dịch chiết của nấm này cũng giảm
metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080. Mới đây
người ta cũng đã phát hiện ra một emzym phân giải protein từ các quả thể khô
của Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và
ung thư bàng quang.


Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá
trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư. Trong một nghiên cứu
Park et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế
bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc
làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế
bào) (Park, Na et al. 2009). Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng
ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết nấm Cordyceps
militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594.

trong máu, ngăn ngừa di căn, chống ung thư cũng như bảo vệ gan và tác dụng
hạ huyết áp (Kim JR, Yeon SH et al. 2002),(Yu R, Song L et al. 2004).
Ergosterol (C28H44O)
Ergosterol là sterol duy nhất có trong nấm và là một tiền chất quan trọng
của vitamin D2, nó có giá trị chữa bệnh quan trọng (Peterson RRM 2008).
Lovastatin
Lovastatin, một trong những chất chuyển hóa thứ cấp trước đây tìm thấy ở
các loài nấm mốc thuộc chi Monascus, là một 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzym A xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol và đã được
chứng minh là có hiệu quả chống viêm, chống oxy hóa, và tính profibrinolytic
và để ngăn chặn hội chứng mạch vành cấp tính và bệnh xơ vữa động mạch
(Aarons CB, Cohen PA et al. 2007).
GABA
GABA là một trong những chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ
thống thần kinh trung ương và ức chế dẫn truyền thần kinh giao cảm ngoại
biên. Một vai trò quan trọng đối với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần kinh
trung ương và ngoại vi đến huyết áp đã được chứng minh (Suzuki R,
Maehara R et al.
2012).


GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần
kinh chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng (Carmans S, Hendriks J et al. 2013).
Ergothioneine
Ergothioneine là một dẫn xuất histidine với lưu huỳnh vào vòng
imidazole và amin trimethylated (Turner E, Klevit R et al. 1986).
Nhiều thử nghiệm cho thấy đây là chất chống oxy hóa và có khả năng
hoạt hóa các tế bào chống lại một loạt các yếu tố gây stress tế bào (Cheah I
and Halliwell B 2012)
Ergothioneine đã được chứng minh là chất tác dụng ngăn ngừa bức xạ và
dọn dẹp các gốc tự do, các gốc hydroxyl, axit hypochlorous, và các gốc


Aspartic

4,75

0,36

Serine

3,13

0,39

Glutamic

8,79

1,40

Glycine

1,84

0,52

Histedine

1,84

0,46


Valine

3,36

0,65

Methionine

0,18

0,07

Lysine

15,06

2,20

Isoleucine

1,16

0,35

Leucine

1,43

0,46


Linoleic

61,3

33,0

Adenosine (%)

0,18

0,06

Cordycepin (%)

0,97

0,36

Acid béo (%)


1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris
1.3.1. Vai trò của giống.
Quả thể nấm được sinh ra cần phải có các điều kiện cần và đủ, đó là
giống nấm và cơ chất có nguồn carbon. Trong đó, giống nấm là yếu tố quyết
định đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra. Một giống khỏe mạnh sẽ
sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và có khả năng
hình thành quả thể tốt. Mỗi giống lại có một khoảng thời gian sử dụng nhất

cho nấm phát triển gồm các monosacharide và polysacharide… Nấm có sự
khác biệt rất lớn trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau.
Các nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn carbon có thể sử
dụng để nuôi trồng nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó thích
hợp nhất là những loại có cấu trúc phân tử nhỏ (Shrestha et al., 2012)
1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng ni tơ
Ni tơ là nguyên tố bắt buộc để tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc
nên tế bào. Dinh dưỡng ni tơ có thể được lấy từ nguồn ni tơ hữu cơ tự nhiên,
nguồn ni tơ tổng hợp, nguồn ni tơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni.
Theo Gao et al. (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng
ni tơ tương đối thấp. Nếu hàm lượng ni tơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm
chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể
1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có thể
làm tăng năng suất quả thể. Một vài nguyên tố có thể làm tăng hoạt chất sinh
học của Cordyceps militaris (Dong et al., 2012).


1.3.2.4. Các loại vitamin
Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris. Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin
cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm
lượng vitamin nhất định
1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá
thể nhân tạo thể rắn
Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,
polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một loại
thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết, chống
viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống
oxi hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng. Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên sản