Header Page 1 of 166.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT
SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS
TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG

Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC
Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN
Lớp
: 49 CNSH
Khoá : 49

Nha Trang, tháng 7 năm 2011

Footer Page 1 of 166.


Header Page 2 of 166.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP


sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người
luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn
thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua.

Nha Trang, tháng 6 năm 2011
Sinh viên
Lê Thanh Huân

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 3 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 4 of 166.
ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................ vii
KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... viii
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics ............................................................................................ 3
1.1.2. Cơ chế tác động của probiotic ................................................................................. 5

Header Page 5 of 166.
iii

1.2.3. Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói
riêng 17
1.2.3.1. Bệnh do nấm, ký sinh trùng ......................................................................... 17
1.2.3.2. Bệnh do virus ................................................................................................. 18
1.2.3.3. Bệnh do vi khuẩn .......................................................................................... 18

1.2 ......................................................................................... . Tổng quan về vi khuẩn lactic 20
1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic ................................................................................ 20
1.3.1.1. Giới thiệu chung ............................................................................................. 20
1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic .............................................................................. 22

1.3.1.2.1. Lên men đồng hình ..................................................................... 22
1.3.1.2.1. Lên men dị hình .......................................................................... 23
1.3.2. Giới thiệu về giống Lactobacillus ........................................................................... 23
1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic ........................ 24

1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi
khuẩn gây bệnh .............................................................................................. 24
1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn ......................................................................... 25
1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa ........................................... 25
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và
Lactobacillus nói riêng. .............................................................................................. 26

1.3.2.1.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng............................................. 26
13.2.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ........................................... 29
1.3.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic
trong nuôi trồng thủy sản ................................................................................................... 30

2.3.2.1.2. Nhuộm Gram ............................................................................... 38
2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa ............................................................................ 39

2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic ............................................................ 39
2.3.2.2.2. Phản ứng catalase ........................................................................ 40
2.3.2.2.3. Khả năng di động ........................................................................ 40
2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường: ............................................ 41
2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy ............................................................................ 41
2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng .................................................................... 41
2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp .......................................................................... 42
2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy .......................................................................... 42
2.3.3.4. Xác định pH thích hợp .................................................................................. 42
2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic ............................................................................. 42
2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa .................................................... 42
2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn ........................................................................ 43

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 44
3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn .............................................................................. 44
3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng .......................................... 44
3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio ........... 44

3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa .......................................................... 46
3.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 46
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2 .............................................................. 46

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 6 of 166.





Header Page 8 of 166.
vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi
trường MRS, ở nhiệt độ 37oC ....................................................................................... 45
Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 .................................. 52

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 8 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 9 of 166.
vii

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1 : Cá chim vây vàng ......................................................................................... 14
Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1,
C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định
bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC ......................... 45
Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi
cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC ............................ 46
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS

viii

KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 10 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 11 of 166.
1

LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển
nhanh chóng. Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản
của Việt Nam là 1,67 triệu tấn, xếp vị trí thứ 6 Châu Á. Hiện nay đối tượng nuôi trồng
chủ yếu là các loài thủy hải sản nước mặn như: cá mú (Epinephelus spp), cá giò
(Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcariper), cá cam (Seriola spp), cá hồng
(Lutijanus erythropterus), cá chim (Trachinotus blochii), ốc hương (Babylonia
areolata), vẹm xanh (Perna viridis), tôm sú (Penaeus monodon),... trong đó đối tượng
nuôi mới là cá chim vây vàng đang được chú ý phát triển nuôi bởi vì thịt cá thơm ngon
hấp dẫn, hàm lượng dinh dưỡng cao, rất được ưa chuộng.
Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) là loài phân bố tương
đối rộng ở vùng biển nhiệt đới, Tây Thái Bình Dương, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia,
miền Nam Trung Quốc. Nước ta cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và
Nam Bộ. Cá có kích cỡ thương mại 0,8 -1 kg/con, giá trị kinh tế cao với giá bán

Lactobacillus.
Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển
chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên
Cá Chim vây vàng”
Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có hoạt
tính kháng Vibrio để bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi cá chim vây vàng nhằm mục
đích tăng tốc độ tăng trưởng, khả năng kháng bệnh, đảm bảo sự phát triển bền vững
của nghề nuôi cá chim vây vàng.
Các nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng.
- Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus.
- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng Lactobacillus.

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 12 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 13 of 166.
3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics
Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO) “Probiotic




SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 14 of 166.
4

trồng hấp thu được. Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong các hệ thống xử lý rác thải và
nước thải, làm sạch dầu mỏ trong các vụ tràn dầu.
Mặc dù vậy, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản (tôm, cua,
cá, nhuyễn thể…) vẫn còn khá mới mẻ, mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây. Đối
với mỗi loài thủy sản khác nhau cần có chế phẩm probiotic với những chủng vi sinh vật
thích hợp riêng. Phương thức sử dụng chủ yếu là bổ sung trực tiếp vào thức ăn hoặc
thêm vào môi trường nước nuôi. Nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận
thấy chế phẩm Probiotic đã tạo ra những thay đổi đáng kể về khu hệ vi sinh trong
đường ruột theo hướng cân bằng có lợi trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số
lượng các vi sinh vật có khả năng gây bệnh như E.coli, Samomella, Listeria…giảm
mạnh. Những phát hiện mới về khả năng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh những sai
lệch bất lợi ở hệ vi sinh vật đường ruột do bênh nhiễm khuẩn, virus, dị ứng thức ăn
đang mở ra triển vọng áp dụng chế phẩm này trong nuôi trồng thủy sản, cân bằng sinh
thái và bảo vệ môi trường.
* Thành phần chế phẩm probiotic
Vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic thường gồm 4 nhóm sau:
- Nhóm vi khuẩn lactic: Thường chọn các chủng vi khuẩn lactic điển hình
thuộc giống Lactobacillus (Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus casei …). Trong hoạt động sống vi khuẩn lactic chuyển đường thành
axit lactic, ngoài ra nó có thể sinh ra Baterioxin – một loại hợp chất có hoạt tính
kháng khuẩn và có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng. Loại chất kháng sinh này không

men sẽ có tác dụng tận dụng lượng đường được tạo thành trong môi trường nước để
lên men rượu nhẹ, hạn chế dinh dưỡng của các loại vi sinh vật gây bệnh khác, cải
thiện mùi và màu của nước.
1.1.2. Cơ chế tác động của probiotic
1.1.2.1. Sản sinh ra các chất ức chế
Các vi khuẩn probiotic sinh các chất ức chế: bacteriocin, siderophores, lysozym,
protease, H2O2, các axit hữu cơ, amoni, diaxetyl…các chất này được sinh ra bên trong
đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn gây hại khác. (Saurabh S, Choudhary AK và Sushma GS, 2005).Ví dụ:
Lactobacillus sp sản sinh ra bacteriocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây
bệnh. Alteromonas sp dòng B-10-31 sản sinh monostatin làm ức chế hoạt tính protease
của Aermonas hydrophyla và Vibrio anguillarum.
1.1.2.2. Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác
Cạnh tranh dinh dưỡng của các vi sinh vật probiotic có vai trò quan trọng trong
việc đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật bên trong đường ruột và bên ngoài môi
trường nuôi. Probiotic có khả năng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng đối với các vi khuẩn
lây bệnh và sẽ hạn chế được sự phát triển, lây lan của các chủng vi sinh vật đó. Vi

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 15 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 16 of 166.
6


Footer Page 16 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 17 of 166.
7

các tế bào tua, từ đó cảm ứng tế bào limpho T để dung nạp/điều hòa và kích thích các
đáp ứng miễn dịch. Ngoài ra, kháng nguyên của vi khuẩn probiotic kích thích tế bào
niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh, các chhất ức chế của
probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ.
Người ta thấy rằng bổ sung vi khuẩn lactic làm tăng khả năng chống lại bệnh
truyền nhiễm đường ruột. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy probiotic có ảnh
hưởng quan trọng đối với các đáp ứng miễn dịch thích ứng ở những bệnh như dị ứng
sữa bò ở trẻ em, viêm khớp tự miễn ở người lớn.
1.1.2.5. Cải thiện chất lượng nước
Chế phẩm probiotic giúp giảm nồng độ các chất hữu cơ trong nước, giảm hàm
lượng BOD, giảm độc do amoni, nitrat và khí hydrosunfua, khống chế được vi khuẩn
gây bệnh. Các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cải thiện chất lượng nước
bởi chúng có thể sử dụng các chất hữu cơ dư thừa hoặc các chất khí như H2S để làm
chất dinh dưỡng thông qua các enzyme ngoại bào. (Prieur và cộng sự,1990).
1.1.3. Ứng dụng của probiotic
1.1.3.1. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong y học, trong trồng trọt, trong bảo
vệ môi trường.
- Trong y học: các chế phẩm probiotic khi được bổ sung vào đường ruột sẽ giúp
làm sạch đường ruột, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, cân bằng hệ sinh thái của các vi
sinh vật trong đường ruột, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại

nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được
hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ (Võ Thị Hạnh
và cộng sự, 2005).
- Trong bảo vệ môi trường: Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối

(sinh ra các loại khí H2S, SO2, NH3…) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải,
cống rãnh, chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng. Đồng thời
số lượng ruồi, muỗi, ve, các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng. Rác hữu cơ
được xử lý EM chỉ sau một ngày có thể hết mùi và tốc độ mùn hoá diễn ra rất nhanh.
Trong các kho bảo quản nông sản, sử dụng EM có tác dụng ngăn chặn được quá trình
gây thối, mốc. Các nghiên cứu cho biết chế phẩm EM có thể giúp cho hệ vi sinh vật tiết
ra các enzym phân huỷ như lignin peroxidase, enzyme amylase, protease, cellulase và
đặc biệt là cellulase, hemicellulase. Các enzym này có khả năng phân huỷ các hoá chất
nông nghiệp tồn dư, thậm chí cả dioxin. Ở Belarus, việc sử dụng EM liên tục có thể
loại trừ ô nhiễm phóng xạ (Teruo Higa, 2002).
1.1.3.2. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 18 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 19 of 166.
9

Mặc dù chế phẩm probiotic mới được ứng dụng vào nuôi trồng thủy sản trong

Footer Page 19 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 20 of 166.
10

Nhiều loại chế phẩm vi sinh được sử dụng để cải thiện môi trường nước nuôi
trồng thủy sản như: chế phẩm EM, BIOnAQUA 1-MV( công ty Mai Việt), BZT®
Aquaculture (USA), BIO II (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005).…
Tăng tốc độ sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho đối tượng nuôi:
Nghề nuôi trồng thủy sản đang đối mặt với các loại bệnh dịch, nguyên nhân chủ
yếu là do các loại vi khuẩn Aeromonas.sp, Pseodomonas.sp, Vibrio sp. Tuy nhiên ,
chúng ta hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng bênh nên chế phẩm probiotic có vai trò
vô cùng quan trọng. Hiện nay trong nuôi trồng thủy sản cũng phân lập được nhiều loại
probiotic như Carnobacterium piscicola (Hius, 1984), Lactobacillus plantarum
(Schroder, 1984), Pediococcus acidilactici (Pucci, 1988 ). Các chủng vi sinh vật có thể
cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng bên trong đường ruột nhờ khả năng chịu mặn,
chịu kiềm, chịu axit của đường ruột. Bên cạnh đó, các chủng probiotic này càng được
chú ý hơn nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế (bacteriocins, sideropheres, lysozymes,
hydrogen peroxides..) và tổng hợp được các hợp chất kháng sinh tương ứng như:
piscicolin, plantarin, pediococin (PA - 1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt đối với vi
khuẩn gây bệnh như: Listeria monocytogenes (Pucci, 1988), Shigella spp. và
Salmonella spp… Vì vậy khi bổ sung chế phẩm probiotic có chứa các vi sinh vật này
vào thức ăn sẽ kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo sự ổn định
của hệ vi sinh vật đường ruột tôm cá, giúp đối tượng nuôi tăng trưởng và phát triển tốt,
chống chọi được với các loại bênh dịch. Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ

1.1.4. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics.
Quy trình tạo chế phẩm probiotic :

Nguyên liệu

Chủng giống

Nhân giống

Lên men

Sinh khối
Chất phụ gia

Chế phẩm dạng
bột

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 21 of 166.



Chế phẩm dạng
dịch

SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 22 of 166.

1.1.4.4. Tạo chế phẩm

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 22 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 23 of 166.
13

Dịch sinh khối sau khi đã xử lý được trộn với chất mang. Chất mang giúp vi
khuẩn có thể tồn tại lâu, nó như chất bảo quản chế phẩm. Chất mang thường là khô đậu
tương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose…
Sau khi trộn chất mang ta tiến hành sấy khô chế phẩm đến độ ẩm 8-12% để bảo quản.
Có thể dùng các phương pháp sấy:
• Sấy nhiệt:
Cho chế phẩm vào thiết bị sấy bình thường ở nhiệt độ 40-500 C trong 4-5h.
Ưu điểm: - Tốn ít chi phí cho thiết bị
- Hao phí cho năng lượng thấp
Nhược điểm: - Thời gian sấy kéo dài
- Không thể tự động hóa được
- Chất lượng sấy kém
• Sấy hút chân không
+ Nguyên lý làm việc: Dưới môi trường áp suất chân không, các khay chứa
nguyên liệu được quay đảo bên trong buồng sấy nhằm tăng hiệu suất sóng cao tần.
Hàm ẩm trong nguyên liệu được gia nhiệt nhanh và bay hơi thoát ra ngoài bề mặt. tăng

chúng phân bố vùng biển Đông Hải, Nam Hải, Hoàng Hải, vùng biển Quảng Đông,
Quảng Tây, Hải Nam, Phúc Kiến. Cá chim vây vàng cũng đã tìm thấy ở vùng biển
nước ta. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung
và Nam Bộ.

Hình 1.1 : Cá chim vây vàng
Cá chim vây vàng có cơ thể hơi tròn và bề bên dẹp chính giữa lưng hình vòng
cung, bề mặt da có màu trắng xám và vây lưng có màu ánh bạc vàng. Cá chim vây
vàng có kích thước tương đối lớn, kích thước có thể đạt 45 - 60 cm. Cá sinh trưởng
nhanh, trong điều kiện nuôi bình thường 1 năm đạt 0,5 - 1 kg/con. Từ năm thứ 2 trở đi
mỗi năm khối lượng tăng tuyệt đối là 1 kg.

GVHD: Th.s Lê Đình Đức

Footer Page 24 of 166.



SVTH: Lê Thanh Huân


Header Page 25 of 166.
15

Cá chim vây vàng là loài cá nước ấm, có tập tính di cư, sống ở tầng giữa và tầng
mặt. Ở giai đoạn cá giống hàng năm sau mùa đông cá thường tập trung thành đàn sống
ở vùng vịnh, cửa sông. Cá trưởng thành sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 22 –
280C, là loài rộng muối 3 - 33 ppt. Dưới 20 ppt cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện
độ mặn cao tốc độ sinh trưởng chậm lại. Nhu cầu hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 2,5
mg/L.