Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN
CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
NGUYÊN PHÁT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN
CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
NGUYÊN PHÁT


Header Page 4 of 126.

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến
PGS. TSHoàng Thị Mỹ Nhung và TS. Trần Huy Thịnh - người thầy đã tận tình
chỉ bảo, hướng dẫn và bổ sung các kiến thức cần thiết cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS. Tạ Thành Văn - Giám đốc trung
tâm Gen và Protein, Trưởng bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội và
PGS.TS. Trần Vân Khánh - Phó giám đốc trung tâm Gen và Protein trường Đại
học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, các chị và các bạn học viên đã
tạo điều kiện và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập kỹ thuật, hoàn thiện
quy trình kỹ thuật và phân tích kết quả tại Trung tâm.
Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học Tế bào, các thầy cô trong
khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện và củng cố thêm
rất nhiều kiến thức cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Đồng thời cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn
bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian vừa qua.
Hà Nội, ngày29 tháng 12 năm 2016
Học viên cao học khóa

Trần Đức Tranh

ii
Footer Page 4 of 126.


Header Page 5 of 126.

MỤC LỤC


Header Page 6 of 126.

2.3.4. Trang thiết bị và hóa chất .............................................................. 31
2.4. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 34
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài ....................................................... 34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 35
3.1.

Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ............................................................ 35
3.1.1. Đặc điểm về tuổi ........................................................................... 35
3.1.2. Đặc điểm về giới ........................................................................... 36

3.2.

Tỷ lệ kiểu gen và alen ALDH2 trong nhóm nghiên cứu ...................... 38
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ................................................................ 38
3.2.2. Kết quả khuếch đại vùng gen ALDH2 chứa SNP tại codon 487 . 40
3.2.3. Kết quả kiểu gen và alen ALDH2................................................. 41

3.3.

Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ khác ................ 47
3.3.1. Gen ALDH2 và độ tuổi phát hiện bệnh UTGNP của các kiểu gen .....47
3.3.2. Mối liên quan của gen ALDH2 với giới tính trong nhóm ung thư
gan nguyên phát ............................................................................ 48
3.3.3. Mối liên quan của gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu. ...... 49
3.3.4. Mối liên quan của gen ALDH2 vớí nhiễm virut HBV ................. 50

KẾT LUẬN .................................................................................................... 52

Minh họa hiện tượng đa hình đơn gen (SNP) ............................ 22

Hình 1.6.

Nguyên lý kỹ thuật PCR ............................................................. 23

Hình 3.1.

Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% .............................. 39

Hình 3.2.

Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP
gen ALDH2 của nhóm bệnh trên agarose 1,5%. ........................... .40

Hình 3.3.

Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP
gen ALDH2 của nhóm chứng trên agarose 1,5%. ....................... 41

Hình 3.4.

Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym
MboII trên mẫu đối chứng. ........................................................ 42

Hình 3.5.

Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym
MboII trên mẫu của bệnh nhân UTGNP. ................................... 43



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADH

: Alcohol Dehydrogenase

ADH1A, ADH1B, ADH1C: Alcohol Dehydrogenase 1A,1B, 1C.
ALDH

: Aldehyde Dehydrogenase

AA

: acetaldehyde

bp

: base pair (cặp ba-zơ)

CI

: Confidence Interval (Độ tin cậy)

Nu

: Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide)

A

: Deoxyadenosine triphosphate

(Hiệntượng đa hình chiều dài của các đoạn DNA cắt bằng enzyme
giới hạn)

ROS

: Radioactive Oxygen Species (gốc tự doôxy hóa)

SNP

: Single Nucleotide Polymorphism
(Hiện tượng đa hình đơn Nucleotide)

UTBMTBG : Ung thư biểu mô tế bào gan
UTGNP

: Ung thư gan nguyên phát

vii
Footer Page 9 of 126.


Header Page 10 of 126.

Bảng viết tắt các acid amin:
Ala

Alanine

Gly


Asp

Aspartic acid

Leu

Leucine

Trp

Tryptophan

Cys

Cysteine

Lys

Lysine

Tyr

Tyrosine

Gln

Glutamine

Met


ALDH gồm nhiều isoenzym trong đó có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm
thấy trong bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2,
enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2. Gen ALDH2 là loại gen
đa hình được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả. Các nghiên cứu trên thế giới đã
chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn nucleotide gen mã hóa cho enzym
ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [66].
Ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là khối u sinh ra từ tế bào biểu mô gan
và tổ chức liên kết, đại đa số xuất phát từ biểu mô gan ( >90%). Hiện nay, ung thư
gan là bệnh đứng hàng thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 trong
các loại ung thưtrên thế giới, ước tính khoảng 500.000 đến 1.000.000 ca mắc mới
trong một năm [39]. Phẫu thuật khối u, tiêm cồn hoặc tiêm hóa chất là phương pháp
điều trị thông dụng hiện nay cho các bệnh nhân nhằm kéo dài thời gian sống cho
bệnh nhân, tuy nhiên chẩn đoán bệnh thường muộn, nên việc điểu trị ít hiệu quả. Do
vậy, xác định và kiểm soát yếu tố nguy cơ để có những biện pháp cảnh báo, chẩn
đoán sớm và phòng ngừa bệnh là yếu tố then chốt góp phần không nhỏ vào chiến
lược ngăn ngừa và phòng chống ung thư gan [5], [10]. Ngoài nguy cơhay gặp gây
UTGNP là nhiễm virut viêm gan B, C… thì yếu tố di truyền liên quan đến gen,
trong đó có ALDH2 và tình trạng sử dụng rượu kéo dài của bệnh nhân là nguy cơ
quan trọng rất cần được đi sâu tìm hiểu và nghiên cứu.

1
Footer Page 11 of 126.


Header Page 12 of 126.

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát thuộc nhóm cao nhất
thế giới, tình trạng lạm dụng rượu rất cao và khó kiểm soát [5], [4]. Hiện nay, các
nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình thái gen mã hóa cho enzym ALDH2 với
UTGNP chưa được nghiên cứu tìm hiểu một cách đồng bộ và bài bản. Chính vì vậy,

Vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao tức là từ 30 trường hợp/100.000 dân/1 năm trở lên gồm
khu vực Đông Á đặc biệt là Trung Quốc, Đông Nam Á và châu Phi (trừ Bắc Phi).
Vùng có tỷ lệ mắc bệnh trung bình là từ 3-30 trường hợp/100000 dân/1 năm như
khu vực Nam Âu, Bắc Phi, Ấn Độ, Nhật Bản.Vùng có tỷ lệ mắc bệnh thấp là
những người không uống rượu [53]. Ngoài số lượng rượu uống, thì thói quen
uống rượu cũng gây tăng tỷ lệ bệnh gan do rượu. Người ta nhận thấy cùng lượng
rượu nếu tỷ lệ sử dụng rượu vang cao thì nguy cơ mắc bệnh gan thấp hơn uống
rượu bia bình thường.
Mặc dù ung thư gan nguyên phát gặp ở nam giới nhiều hơn nữ giới nhưng
những trường hợp phụ nữ cùng uống lượng rượu như nam giới có nguy cơ mắc
bệnh về gan lại cao hơn nam giới. Một số tác giả cho rằng enzym ADH ở dạ dày ở
nữ thấp hơn nam giới, nhưng điều này còn chưa có bằng chứng thuyết phục và còn
được các nhà nghiên cứu đang tìm hiểu thêm. Hiện nay, các giả thuyết nghiêng về
estrogen làm tăng nhạy cảm với nội độc tố từ ruột và gây bệnh gan. Bởi vậy ngưỡng
nguy hiểm ở nam giới thường được xem là khoàng 40g/ngày còn ở phụ nữ chỉ là
20g/ngày [5], [4]. Ngoài ra, nghiên cứu ở Mỹ cho thấy những người nguồn gốc Tây
Ban Nha có nguy cơ mắc bệnh gan do rượu cao hơn người Mỹ da đen và da trắng.
Các bệnh lý phối hợp: viêm gan B, C,tình trạng rối loạn chuyển hóa, béo phì, đái
tháo đường… làm tăng cảm thụ với tổn thương gan do rượu do đó làm hạ ngưỡng nguy
cơ của rượu [34], [49].
- Aflatoxin (AF)
Là một mycotoxin được tiết ra từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus,
thường được mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc ẩm ướt. Độc tố từ loại nấm này làm
thương tổn và thay đổi cấu trúc DNA của nhiều gen khác nhau trong đó có gen
p53 làm mất kiểm soát chu kỳ phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành và phát
triển UTGNP [60], [33].
- Xơ gan
Khoảng 95% UTGNP đều phát triển trên một gan đã bị xơ, nhất là xơ gan do
viêm gan, xơ gan do bệnh tự miễn, do ứ mật, và xơ gan do rượu…
- Các nguy cơ khác
Gan nhiễm mỡ, hóa chất gây độc cho gan, bệnh ký sinh trùng, thuốc lá, yếu tố
nội tiết, yếu tố dinh dưỡng cũng là các yếu tố nguy cơ gây tổn thương gan và ung
thư gan [5], [4].


UTGNP thấy hình tăng mạch máu trong khối u [48], [26].
Ngoài ra, sử dụng các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh khác như chụp cắt lớp vi
tính (CTscanner), chụp cộng hưởng từ (MRI)… được sử dụng để giúp xác định kích
thước và vị trí khối u, và tình trạng di căn của tổ chức ung thư.

6
Footer Page 16 of 126.


Header Page 17 of 126.

 Mô bệnh học của UTGNP: Các khối u nguyên phát gan phát sinh từ thành
biểu mô (90%) hoặc từ thành phần không phải biểu mô [48], [26], [1].
 Tế bào học của UTGNP: Trên tiêu bản các tế bào u tập trung thành từng
đám, giải bè, có tế bào nhân trần, nhân thoái hóa, màng nhân méo mó, nhân quái,
nhiều nhân [48], [26].
1.1.4. Điều trị và tiên lượng UTGNP
1.1.4.1.Điều trị
Tùy theo giai đoạn của ung thư lựa chọn các phương pháp điều trị [26], [52].
- Giai đoạn rất sớm: Phẫu thuật khối u, cắt thùy gan.
- Giai đoạn sớm: Phá hủy khối u bằng tiêm ethanol qua da dưới hướng dẫn
siêu âm hoặc sóng cao tần.
- Giai đoạn phát triển: Nút mạch bằng hóa chất
- Giai đoạn muộn: Liệu pháp điều trị đích.
- Giai đoạn cuối: Chống đau và điều trị triệu chứng
Các phương pháp điều trị [5], [26], [52].
1.1.4.2.Tiên lượng
Bệnh nhân UTGNP tiên lượng rất xấu, thường chẩn đoán giai đoạn muộn khi
khối u đã xâm lấn di căn nhiều nơi. Thời gian sống trung bình bệnh nhân từ khi
chẩn đoán thường là 6 tháng đến 12 tháng. Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là < 5% ở các

dày, chức năng chuyển hóa ethanol hiện nay vẫn chưa biết rõ. ADH7 có nhiều ở dạ
dày và đường tiêu hóa trên, tham gia chuyển hóa ethanol [25], [24], [71].

8
Footer Page 18 of 126.


Header Page 19 of 126.

Bảng 1.1. Các isoenzym ADH ở người [41].
Sai khác acid

Danh pháp gen
Nhóm

I

Mới

Cổ điển

ADH1A

ADH1

Protein

alen
Α


ADH1C*2 ADH3*2

Mô

amin giữa các

Gan, Phổi

Gan, Dạ dày

II

ADH4

ADH4

Π

Gan

III

ADH5

ADH5

Χ

Mọi mô



9
Footer Page 19 of 126.


Header Page 20 of 126.

hóa bởi gen đa hình thái được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả. Các nghiên cứu
trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn mã hóa cho enzym
ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [70], [69], [14], [19].
ALDH2*2 là do sự thay thế glutamate bằng lysine ở vị trí acid amin 504. Hậu
quả dẫn đến sự tạo thành enzyme ALDH2 gần như mất hoạt tính oxy hoá
acetaldehyde thành acetate. Các nghiên cứu dịch chiết gan cho thấy alen ALDH2*2
trội so với alen ALDH2*1 (những người mang một alen ALDH2*2và một alen
ALDH2*1, dạng dị hợp tử) cũng không phát hiện thấy hoạt tính của enzyme ALDH
[23]. Các nghiên cứu tạo dòng các alen này trên tế bào nuôi cấy cũng thu được kết
quả tương tự [55].
Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều
Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi [32], [64], [67].
Những người mang alen ALDH2*2 lượng acetaldehyde trong máu tăng từ mức
gần như không phát hiện được tới mức cao và gây nên các phản ứng bao gồm nôn
nặng, buồn nôn, nhịp tim nhanh và các phản ứng như khi dùng các thuốc điều trị
nghiện rượu. Một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống tình trạng phụ
thuộc rượu khi có mặt alen ALDH2*2[15], [64].
Nghiên cứu tiến hành so sánh 2 nhóm nam giới Trung Quốc, một nhóm mang
2 alen hoạt động ALDH2*1 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1 , một
nhóm mang 1 alen bất hoạt ALDH2*2 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1.
Kết quả cho thấy OR của người nghiện rượu giữa 2 nhóm là 0,33. Nếu có thêm alen
ALDH2*2, người đó mang ít nhất 1 alen tăng hoạt động ADH1B*2, thì OR còn
giảm xuống 0,05.

1.2.2. Chuyển hóa rượu tại gan
Khi rượu vào cơ thể, 2-8% đào thải qua mồ hôi, nước tiểu và hơi thở, 92-98%
được chuyển hóa trong cơ thể. Trong số đó, một lượng nhỏ rượu sẽ được chuyển
hóa tại dạ dày và 92-95% từ đường tiêu hóa vào máu tới gan và được chuyển hóa tại
gan. Quá trình chuyển hóa tại gan có 2 con đường là oxy hóa và không oxy hóa.
Quá trình oxy hóa ethanol tại gan gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn chuyển từ ethanol thành acetaladehyde:
Có 3 loại enzym tham gia giai đoạn này
 Enzym ADH có tác dụng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, vận chuyển
proton H+gắn với coenzym NAD+ thành NADH. ADH hoạt động trong bào tương tế
bào gan.

11
Footer Page 21 of 126.


Header Page 22 of 126.

 Enzym Cytochrome P450 2E1 của gan, tham gia chuyển hóa ethanol thành
aldehyd và NADPH thành NADP+
 Enzym Catalase có mọi nơi trong cơ thể tham gia chuyển hóa ethanol thành
aldehyde và giải phóng O2 từ H2O2 tạo thành H2O. Enzym tham gia chuyển hóa
rượu ở não liên quan đến dẫn truyền thần kinh.

- Giai đoạn chuyển hóa từ acetaldehyde thành acetate
Tham gia phản ứng này là enzymacetaldehyde dehydrogenase với vai trò
chuyển aldehyde thành acetate và H+sẽ được gắn với NAD+tạo thành NADH.
Enzym này hoạt động trong ty thể và được tìm thấy trong tế bào ở nhiều cơ quan
khác nhau trong đó nhiều nhất là ở tế bào gan [25], [24], [71]. Khi acetate được tạo

1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan.
Các con đường chuyển hóa ethanol đã gây ra hậu quả bất lợi, làm tổn thương
mô và tế bào, gây bệnh ở những bệnh nhân nghiện rượu. Hậu quả bao gồm thiếu
oxy tại gan, hình thành các chất độc, các gốc tự do oxy hóa (ROS), thay đổi tỷ lệ
NADH/ NAD+ (thay đổi oxy hóa khử của tế bào).
- Thiếu máu tại gan.
Con đường chủ yến chuyển hóa ethanol dưới xúc tác của ADH và ALDH tạo
ra NADH sẽ tiếp tục tham gia vào vận chuyển electron trong ty thể hoặc chuỗi hô
hấp tế bào. Để đáp ứng quá trình vận chuyển electrons, tế bào gan cần lượng oxy
nhiều hơn mức bình thường. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuyển hóa rượu có xu
hướng làm tăng hấp thụ oxy từ máu của tế bào gan. Tiêu thụ rượu mãn tính gây
thiếu oxy đến gan làm tổn thương tế bào gan. Ngoài ra, ethanol gián tiếp gây tăng
sử dụng oxy do hoạt hóatế bào Kuffer ở gan, làm tình trạng thiếu oxy tại tế bào gan
trở nên trầm trọng hơn. Khi các tế bào này bị hoạt hóa, chúng giải phóng phân

12
Footer Page 22 of 126.


Header Page 23 of 126.

tửnhư prostaglandin E2… gây kích thích một loạt các phản ứng khác đòi hỏi tiêu
thụ nhiều oxy hơn tại gan [71].
- Hình thành chất độc.
Chuyển hóa ethanol với sự xúc tác ADH và CYP2E1 hình thành acetaldehyde
và ROS tương tác protein và các phân tử khác hình thành chất độc bền vững và
không bền vững. Acetaldehyde là chất độc gây đột biến gen và ung thư,
Acetaldehyde gắn với DNA hình thành “DNA adduct”. Vai trò của Acetaldehyde
gây ung thư do rượu có liên quan đến di truyền. Hiện tượng đa hình thái hoặc biến
đổi gen mã hóa có liên quan đến tăng hay giảm nồng độ AA [61].


thành acetaldehyde bởi enzym ADH, sau đó được vận chuyển vào ty thể. Tại ty thể
NADH được hình thành nhờ enzym ALDH. Tỷ lệ này ảnh hưởng đến biểu hiện của
gen, kích hoạt các gen [45].
Tóm lại: Quá trình chuyển hóa rượu gây nhiều yếu tố có hại cho tế bào, mô,
các cơ quan, và các chuyển hóa khác trong cơ thể. Tại gan, người ta thấy ảnh hưởng
của rượu làm tổn thương tế bào gan là thường gặp nhất. Nghiện rượu, giai đoạn đầu
là gan nhiễm mỡ, sau đó là hiện tượng viêm, xơ hóa vàxơ gan do rượu. Stickel
(2002) đã chứng minh rằng nghiện rượu có vai trò rất quan trọng phát triển UTGNP
(hình 1.2) [28].

Hình thành
ung thƣ gan?

Chu trình Krebs

Hình 1.2. Chuyển hóa rƣợu ở gan và vai trò hình thành ung thƣ gan
Alcohol được chuyển hóa thành acetaldehyde dưới tác dụng của enzym ADH
và cytochrom P4502E1, acetaldehyde gắn với DNA tạo thành “DNA adduct” và
gắn protein tạo thành sản phẩm gây độc cho cơ thể, có thể hình thành ung thư.
Enzym ALDH chuyển acetaldehyde thành sản phẩm không độc là acetate, chất này
đi vào chu trình Krebs. Quá trình chuyển hóa ethanol hình thành ROS tạo ra chất
MDA-4HNE có thể gắn DNA tạo “DNA adduct”, chất này tạo ra có thể hình thành ung
thư gan.

15
Footer Page 25 of 126.