BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

UÔNG THỊ THU HƯƠNG

NGHI£N CøU TÝNH §A H×NH TH¸I §¥N CñA GEN
ADH1C
TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ GAN NGUY£N PH¸T

Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số

: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học
TS. Trần Huy Thịnh


Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và
sâu sắc đến TS Trần Huy Thịnh - người thầy đã tận tình chỉ báo, hướng dẫn
và bổ sung các kiến thức cần thiết cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa
luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Tạ Thành Văn - Giám đốc trung
tâm Gen và Protein và TS Trần Vân Khánh – Phó giám đốc trung tâm Gen và

1.2.1. Hệ thống enzym ADH và ALDH 10
1.2.2. Chuyển hóa rượu tại gan 12


1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan. 13
1.3. Sơ lược về gen ADH1C 17
1.3. Sơ lược về gen ADH1C 17
1.3.1. Vị trí và liên quan 17
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của ADH1C 17
1.3.3. Tính đa hình thái của gen ADH1C 18
1.3.4. ADH1C gen và bệnh ung thư 19
1.4. Kỹ thuật xác định đa hình thái đơn gen ADH1C 20
1.4. Kỹ thuật xác định đa hình thái đơn gen ADH1C 20
1.4.1. SNPs 20
1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình thái đơn: 23

CHƯƠNG 2 30
CHƯƠNG 2 30
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Đối tượng nghiên cứu 30
2.1. Đối tượng nghiên cứu 30
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31
2.3. Phương pháp nghiên cứu 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu 32
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: 32
2.3.2. Cỡ mẫu: 32
2.3.3. Cách thức tiến hành. 33
2.3.4. Trang thiết bị và hóa chất 34

3.3.4. Mối tương quan gen ADH1C vớí nhiễm virut HBV 50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 52
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 52
4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu: 52
4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu: 52
4.1.1. Đặc điểm về tuổi của nhóm ung thư gan nguyên phát 52
4.1.2. Đặc điểm về giới của nhóm ung thư gan nguyên phát 53
4.1.3. Đặc điểm mắc viêm gan B của nhóm ung thư gan nguyên phát. 54
4.1.4. Tình trạng sử dụng rượu của nhóm nghiên cứu. 55
4.1.5. Đặc điểm nhóm chứng của nhóm nghiên cứu. 55
4.2. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu. 55
4.2. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu. 55
4.2.1. Phương pháp xác định SNP của gen ADH1C bằng kỹ thuật PCRRFLP. 55
4.2.2. Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C trong nhóm nghiên cứu 57
4.3. Mối tương quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ. 58
4.3. Mối tương quan giữa gen ADH1C với một số yếu tố nguy cơ. 58

KẾT LUẬN 62
KẾT LUẬN 62
KIẾN NGHỊ 64
KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30


PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH
Hình 0.1 Hình ảnh mô học ung thư biểu mô tế bào gan...............

Bảng 0.2 Gen ADH1C [25]............................................................
Bảng 0.3 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn............................
Bảng 0.4: Hàm lượng rượu tiêu thụ trung bình trong 1 ngày
[38]...................................................................................................
Bảng 0.5 Đặc điểm tuổi của nhóm nghiên cứu............................
Bảng 0.6 Đặc điểm giới của nhóm nghiên cứu............................
Bảng 0.7 Đặc điểm mắc viêm gan B của nhóm nghiên cứu.......
Bảng 0.8 Tình trạng sử dụng rượu của nhóm nghiên cứu.........
Bảng 0.9 Tỷ lệ kiểu gen ADH1C của 2 nhóm..............................
Bảng 0.10 Tỷ lệ kiểu gen và alen ADH1C của 2 nhóm...............
Bảng 0.11 Gen ADH1C và độ tuổi trung bình phát hiện
bệnh của các kiểu gen....................................................................
Bảng 0.12 Gen ADH1C và giới trong nhóm bệnh.......................
Bảng 0.13 ADH1C với tình trạng sử dụng rượu.........................
Bảng 0.14 ADH1C với nhiễm virut HBV.....................................
Bảng 0.15 So sánh tuổi trung bình của bệnh nhân UTGNP
với các nghiên cứu..........................................................................


Bảng 0.16 So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các
nghiên cứu......................................................................................
Bảng 0.17 So sánh tỷ lệ nhiễm HBV của bệnh nhân UTGNP
với các nghiên cứu..........................................................................
Bảng 0.18 So sánh kiểu gen ADH1C với các nghiên cứu trên
thế giới.............................................................................................
Bảng 0.19 So sánh kiểu gen ADH1C*1/*1 với nghiên cứu
trên thế giới....................................................................................


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


: Thymidine triphosphate

G

: Deoxyguanosine triphosphate

C

: Deoxycytidine triphosphate

OD

: Optical Density (Độ hấp thụ quang)

PCR

: Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuyếch đại chuỗi polymerase)

RFLP

: Restriction Fragment Length Polymorphism
(Hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn DNA)

SNP

: Single Nucleotide Polymorphism
(Hiện tượng đa hình thái đơn Nucleotide)


Ser

Serine

Asn

Asparagine

Ile

Isoleucine

Thr

Threonine

Asp

Aspartic acid

Leu

Leucine

Trp

Tryptophan

Cys


vvv


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiện rượu mạn tính là một trong những nguy cơ cao gây ung thư gan.
Khi rượu vào cơ thể, ethanol sẽ được chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde,
đây là chất gây độc và làm hủy hoại tế bào gan. Acetaldehyde còn là chất gây
ung thư do gắn với DNA tạo sản phẩm DNA adduct làm cho khối u phát
triển[1],[2]. Quá trình tạo ra acetaldehyde từ ethanol được xúc tác bởi enzym
alcohol dehydrogenase (ADH), đây là enzym có nhiều biến thể (được gọi
isoenzym), trong đó các isoenzym ADH nhóm I chuyển hóa >92% lượng
ethanol tại gan [3]. Gen mã hóa cho ADH nhóm I là ADH1A.ADH1B,
ADH1C, trong đó gen ADH1B, ADH1C là gen đa hình thái đơn. Nhiều
nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình thái đơn mã
hóa cho enzym ADH1C có liên quan đến bệnh ung thư [4]. Năm 1997 Harty
và cs đã phát hiện người mang alen ADH1C*1 và kiểu gen đồng hợp tử
ADH1C*1/*1 , nghiện rượu có nguy cơ ung thư hầu họng tăng gấp 40 lần so
với người không sử dụng rượu, trong khi đó với kiểu gen đồng hợp tử
ADH1C*2/*2 thì nguy cơ ung thư chỉ gấp 4 lần [5]. Homanm N và cs (2006)
đã thấy rằng tần số alen ADH1C*1 và kiểu gen ADH1C*1/*1 cao hơn và và
có ý nghĩa ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) liên quan
rượu so với nhóm chứng với (p90%). Hiện
nay, ung thư gan là bệnh đứng hàng thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong
đứng hàng thứ 3 trong các loại ung thư trên thế giới, ước tính khoảng



3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về ung thư gan nguyên phát
Dịch tễ UTGNP
- Tỷ lệ phát bệnh chung trên thế giới
UTGNP là một bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới, chẩn đoán
khó, thường phát hiện muộn, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian
sống bệnh nhân ngắn. Theo thống kê của WHO UTGNP là ung thư đứng thứ
5 ở nam giới và hàng thứ 9 ở nữ giới, số lượng bệnh nhân mới mắc trong 1
năm là 564.000 trong đó đại đa số là ung thư biểu mô tế bào gan.
Tuy nhiên tỷ lệ phát bệnh UTGNP khác nhau tùy theo khu vực địa lý trên thế
giới. Vùng có tỷ lệ phát bệnh cao tức là 30 trường hợp/100.000 dân/ 1 năm
gồm Đông Á trong đó Trung Quốc tỷ lệ mắc bệnh cao, Đông Nam Á, châu
Phi. Vùng có tỷ lệ phát bệnh trung bình từ 3-30/ trường hợp/ 100000 dân/ 1
năm như Nam Âu, Bắc Phi, Ấn Độ, Nhật Bản. Vùng có tỷ lệ phát bệnh thấp


- Rượu
Rượu là yếu tố nguy cơ quan trọng trong UTGNP. Tuy rượu không có
tác dụng gây ung thư trực tiếp nhưng vai trò độc hại của rượu uống kéo dài
nhiều năm đã được chứng minh là có liên quan đến nhiều bệnh ung thư[4].
Rượu uống kéo dài nhiều năm sẽ gây nguy cơ xơ gan và là cơ sở chắc chắn
gây UTGNP (60-90% trường hợp). Ở California, một nghiên cứu trên người
nghiện rượu không tăng ở những người uống rượu vừa nhưng nguy cơ tăng
lên gấp 4 lần ở người uống rượu nhiều >80g/ngày [11]. Ở nghiên cứu khác
trên bệnh xơ gan cho thấy nguy cơ UTGNP cao gấp 13 lần ở những người
uống rượu nhiều so với những người không uống rượu [12]. Ngoài số lượng
rượu uống, thì thói quen uống rượu cũng gây tăng tỷ lệ bệnh gan do rượu.
Người ta nhận thấy cùng lượng rượu nếu tỷ lệ rượu vang cao thì tỷ lệ mắc
bệnh gan thấp hơn uống rượu bia bình thường.
Phụ nữ cùng uống lượng rượu như nam giới có nguy cơ bệnh gấp 2 lần
nam giới. Một số giả cho rằng men ADH ở dạ dày ở nữ thấp hơn nam giới,
nhưng điều này còn đang bàn cãi. Hiện nay, các giả thuyết nghiêng về
oestrogen làm tăng nhạy cảm với nội độc tố từ ruột và gây bệnh gan. Bởi vậy
ngưỡng nguy hiểm ở nam giới thường được xem là khoàng 40g/ngày còn ở
phụ nữ chỉ 20g/ngày.
Chủng tộc: nghiên cứu ở Mỹ cho thấy nguồn gốc Tây Ban Nha có nguy
cơ bệnh gan do rượu cao hơn người Mỹ da đen và da trắng.
Các bệnh lý phối hợp: viêm gan B, C. các rối loạn chuyển hóa, béo phì,
đái đường… làm tăng cảm thụ với tổn thương gan do rượu do đó làm hạ ngưỡng
nguy cơ của rượu [1].
Tại Việt Nam, tình trạng sử dụng rượu chưa được kiểm soát vì vậy rượu
là yếu nguy cơ cao gây bệnh gan.


6

lượng AFP huyết thanh thấp hoặc trung bình. Như vậy, vẫn còn tỷ lệ ung thư
gan (khối u nhỏ) thì hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng, làm
hạn chế khả năng chẩn đoán ung thư gan. Chính vì vậy một số dấu ấn ung thư
khác được như AFP ái lực Lectin, DCP, Alpha-L-Fucosidase đang được
nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong lâm sàng.
•Siêu âm
Siêu âm 2D: Hình ảnh một khối u giai đoạn sớm
- Giai đoạn muộn: Liệu pháp điều trị đích.
- Giai đoạn cuối: Chống đau và điều trị triệu chứng
Các phương pháp điều trị [7],[13]
- Tia xạ
- Y học hạt nhân
- Tiêm cồn qua da
- Tiêm acid acetic
- Đốt nhiệt cao tần
- Tắc mạch hóa dầu chọn lọc
- Phẫu thuật cắt khối u
- Giảm đau và điều trị triệu chứng.
- Ghép gan


10

1.1.1.3 Tiên lượng
Bệnh nhân UTGNP tiên lượng rất xấu, chẩn đoán giai đoạn muộn khi
khối u đã xâm lấn di căn nhiều nơi. Thời gian sống trung bình bệnh nhân từ
khi chẩn đoán thường là 6 tháng đến 12 tháng. Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là

Bảng 0.1 Các isoenzym ở người [14]
Nhó
m

Danh pháp gen
Protein
Mới

Cổ điển

ADH1A

ADH1

Sai khác acid amin
giữa các alen

Α

Gan

ADH1B*1 ADH2*1

β1

Arg48, Arg370

ADH1B*2 ADH2*2

β2


ADH4

ADH4

Π

Gan

III

ADH5

ADH5

Χ

Mọi mô

IV

ADH7

ADH7

σ(µ)

Dạ dày



thành aldehyde và giải phóng H+ từ H2O2 tạo thành H2O. Enzym tham gia
chuyển hóa rượu ở não liên quan đến dẫn truyền thần kinh.
- Giai đoạn chuyển hóa từ acetaldehyde thành acetat


13

Tham gia phản ứng này là enzym acetaldehyde dehydrogenase, vai trò
chuyển aldehyde thành acetat và H+ sẽ được gắn với NAD+ tạo thành
NADH. Enzym này hoạt động trong ty thể và được tìm thấy ở nhiều cơ quan,
nhiều nhất là ở gan.[3],[15],[16]
Sản phẩm tạo thành chuyển hóa ethanol ở gan [2],[15,[16].
• Acetat tạo ra vào máu và đi vào chu trình Krebs.
• “Acetaldehyde adducts”.
• Tăng ROS (các loại phản ứng oxy hóa).
• Tăng tỷ lệ NADH/NAD+.
1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan.
Các con đường chuyển hóa ethanol đã gây ra hậu quả bất lợi, làm tổn
thương mô và tế bào, gây bệnh ở những bệnh nhân nghiện rượu. Hậu quả bao
gồm thiếu oxy tại gan, hình thành các chất độc (adducts), các loại chất oxy
hóa (ROS), thay đổi tỷ lệ NADH/ NAD+ (thay đổi oxy hóa khử của tế bào).
- Thiếu máu tại gan.
Con đường chủ yến chuyển hóa ethanol dưới xúc tác của ADH và ALDH
tạo ra NADH sẽ tiếp tục tham gia vào vận chuyển electron trong ty thể hoặc
chuỗi hô hấp tế bào. Để đáp ứng quá trình vận chuyển electrons, tế bào gan
cần lượng oxy nhiều hơn mức bình thường. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuyển
hóa rượu xu hướng làm tăng hấp thụ oxy từ máu của tế bào gan. Tiêu thụ rượu
mãn tính gây thiếu oxy đến gan làm tổn thương tế bào gan. Ngoài ra, ethanol
gián tiếp gây tăng sử dụng oxy do hoạt hóa tế bào Kuffer ở gan, càng gây
tình trạng thiếu oxy tại tế bào gan. Khi các tế bào này bị hoạt hóa, chúng giải