BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN TÂN

§¸NH GI¸ TÝNH §A H×NH rs2070803
Vµ rs4072037 GEN MUC1
TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ D¹ DµY
Chuyên ngành : HÓA SINH
Mã số

: 60720106

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG

HÀ NỘI – 2018
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


A

: Adenine

AJCC

: American Joint Committee of Cancer

MUC1

: Mucin 1.

NA

: Not available (Không có thông tin)

NCBI

: National center for biotechnology information
(Trung tâm quốc gia về thông tin kỹ thuật sinh học).

OD

: Optical density (độ hấp thụ quang).

OR

: Odds ratio (tỷ suất chênh).

PCR

: Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen).

SNP

: Single nucleotide polymorphism
(hiện tượng đa hình thái đơn nucleotid).


1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein MUC1...................................................11
1.3. Tính đa hình thái đơn nucleotid của gen MUC 1.................................16
1.4. Tình hình nghiên cứu về SNP rs2070803 và rs4072037......................18
1.5. Kỹ thuật RFLP-PCR.............................................................................20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............25
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................25
2.1.1. Địa bàn nghiên cứu.......................................................................25
2.1.2. Thời gian triển khai nghiên cứu....................................................25
2.2. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................25
2.2.1. Đối tượng......................................................................................25
2.2.2. Cỡ mẫu thuận tiện.........................................................................25
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................25
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu........................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................33
3.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu...........................................................33
3.2. Đánh giá tính đa hình SNP rs2070803 và rs4072037 của gen MUC1
trên bệnh nhân ung thư dạ dày............................................................36
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA................................................................36
3.2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1.5%..................39
3.2.3. Kết quả kiểu gen tại vị trí rs2070803 và rs4072037.....................40
3.3. Xác định tính nhạy cảm rs2070803 và rs4072037 của gen MUC1 trên
bệnh nhân ung thư dạ dày...................................................................48


CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..............................................................................52
4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu...........................................................52
4.2. Tỷ lệ các kiểu gen và alen tại vị trí rs2070803 và rs4072037..............54
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA................................................................54
4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR.....................................................55
4.2.3. Kết quả điện di sản phẩm cắt enzym.............................................56

Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen và alen của SNP rs2070803 trên gen MUC1..........44
Bảng 3.10: Tỷ lệ kiểu gen và alen của SNP rs4072037 trên gen MUC1.......44
Bảng 3.11. Nguy cơ mắc bệnh của các cặp kiểu gen và alen rs2070803........45
Bảng 3.12. Nguy cơ mắc bệnh của các cặp kiểu gen và alen rs4072037........46
Bảng 3.13. Nguy cơ mắc bệnh của người mang alen lành tại 2 vị trí
rs2070803 và rs4072037.................................................................47
Bảng 3.14: Phân tích mối liên quan tính đa hình rs2070803 và một số yếu tố
nguy cơ UTDD................................................................................48
Bảng 3.15: Phân tích mối liên quan tính đa hình rs4072037 và một số yếu tố
nguy cơ UTDD................................................................................49
Bảng 3.16: Khảo sát tỷ lệ kiểu gen SNP rs2070803 với một số đặc điểm trong
nhóm bệnh.......................................................................................50


Bảng 3.17: Khảo sát tỷ lệ kiểu gen SNP rs4072037 với một số đặc điểm trong
nhóm bệnh.......................................................................................51
Bảng 4.1: Các kết quả nghiên cứu từ Tokyo, Aichi và Korea .......................59
Bảng 4.2: Tỷ lệ các kiểu gen và alen của SNP rs4072037 theo các nghiên cứu
trên thế giới.....................................................................................61


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi trên thế giới.......................................3
Hình 1.2: Vị trí tổn thương trong ung thư dạ dày......................................................6
Hình 1.3: Phân loại hình ảnh đại thể theo Borrmann.................................................8
Hình 1.4: Vị trí của gen MUC1................................................................................11
Hình 1.5: Cấu trúc gen MUC1 và các biến thể .......................................................11
Hình 1.6: Cấu trúc của protein MUC1, chia tách bởi protease và vùng nhận liên kết
đuôi tế bào chất trên MUC1...................................................................13

Hình 4.3: Nguy cơ mắc UTDD ở người mang alen G so với alen A .......................63
Hình 4.4: Sự khác biệt về sản phẩm của SNP rs4072037 .......................................63
Hình 4.5: Kết quả phân tích mối liên quan giữa tính đa hình MUC1 rs4072037 A>G
với nguy cơ UTDD.................................................................................66


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD), trong đó chủ yếu là ung thư biểu mô dạ dày, là một
trong những bệnh ung thư phổ biến nhất, với số lượng mắc mới trên thế giới lên tới
952.000 ca mỗi năm. Năm 2012, UTDD là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ
ba trên thế giới; 70% số ca được báo cáo đó là ở những nước đang phát triển, một
nửa trong số này là ở Đông Á [1]. Việt Nam thuộc khu vực nguy cơ UTDD trung
bình cao, với tỷ lệ mắc mới chuẩn hóa theo tuổi là 21,8 ở nam và 10,0 ở nữ mỗi
100.000 dân [2].
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng UTDD
hiện nay vẫn còn xấu, đặc biệt là ung thư dạ dày tiến triển, với tỷ lệ sốngthêm 5
năm chỉ khoảng 28% [3]. Các liệu pháp hóa trị là cần thiết ở đa số bệnh nhân ung
thư dạ dày tiến triển, nhưng chúng chỉ cải thiện tiên lượng ở một số ít bệnh nhân có
chọn lọc với thời gian sống thêm tối đa không quá 12 tháng và độc tính cao [4]. Bên
cạnh đó, hiện nay, vẫn chưa có dấu ấn sinh học nào giúp lựa chọn bệnh nhân vào
các liệu pháp hóa trị này.
Chính vì vậy, việc xác định các yếu tố nguy cơ để dự phòng và phát hiện sớm
UTDD sẽ là một hướng nghiên cứu mới của nền y học hiện đại. Trong các yếu tố
nguy cơ liên quan đến môi trường và lối sống thì yếu tố di truyền đóng vai trò khá
quan trọng đối với sự hình thành và phát triển ung thư. Trong những năm gần đây,
cùng với sự hình thành và phát triển mạnh mẽ của ngành Y sinh học phân tử, đã có
nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại ung
thư nói chung và UTDD nói riêng đã được ứng dụng. Nguyên tắc chung của
phương pháp này là sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các gen gây ung thư.

2.

Xác định mối liên quan giữa đa hình rs2070803 và rs4072037 với một số
yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày.


3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về ung thư dạ dày
1.1.1. Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ ung thư dạ dày
1.1.1.1. Dịch tễ học
Ung thư dạ dày (UTDD) là một loại ung thư thường gặp, với khoảng 989.000
trường hợp mắc mới mỗi năm trên toàn thế giới [12]. Tổ chức Y tế Thế giới ước tính
trong năm 2012, UTDD chiếm 723.000 trường hợp tử vong trên toàn thế giới [13].
UTDD phân bố không đồng đều trên thế giới, sự biến đổi địa lý ảnh hưởng lớn đến đến
tỷ lệ mắc bệnh này trên toàn thế giới, có tới khoảng hai phần ba số bệnh nhân UTDD là
ở các nước đang phát triển. Tỷ lệ mắc cao nhất được thấy ở Nhật Bản, Nam Mỹ, Đông
Âu, tỷ lệ mắc thấp nhất ở Bắc Mỹ, Ấn Độ, Nigieria và Úc [14].

Hình 1.1: Tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi trên thế giới
(trên 100.000 người) [11]
Việt Nam thuộc khu vực có tỷ lệ mắc UTDD trung bình cao, với tỷ lệ mắc
UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 21,8 và ở nữ là 10,0 mỗi 100.000 dân [2].
Theo nghiên cứu của Trần Văn Huy tại Bệnh viện Trung ương Huế, trong nhóm
bệnh ung thư tiêu hóa, UTDD chiếm tỉ lệ cao nhất (52,4%) [15].


4
1.1.1.2. Các yếu tố nguy cơ

5
UTDD giảm còn 0,80 mỗi khi tăng tuổi mãn kinh 5 năm. Người sinh đẻ khi nhỏ hơn
30 tuổi có nguy cơ UTDD tăng hơn 1,9 lần so với người sinh đẻ lúc lớn hơn 30 tuổi.
Sau khi mãn kinh, tỷ số nguy cơ UTDD tăng 1,26 lần mỗi 5 năm [25].

 Yếu tố nguy cơ liên quan với vật chủ
- Yếu tố di truyền: UTDD thường xảy ra trên người có nhóm máu A và
cũng thường gặp trong cùng gia đình và anh em sinh đôi [16]. UTDD thể lan tỏa
di truyền là một loại UTDD di truyền được xác định rõ là do đột biến dòng phôi
trong gen E-cadherin (CDH1) [26].
- Polyp dạ dày: U tuyến chiếm khoảng 10% polyp dạ dày, là các khối u xuất
phát từ tổ chức tuyến của dạ dày, có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao nhất.
Khoảng 2% polyp tăng sản cũng có thể phát triển thành ung thư. Các polyp tuyến
đáy vị thường gặp ở phần đáy dạ dày, không diễn biến thành ác tính trừ những
người có hội chứng đa polyp tuyến gia đình [22].
- Loét dạ dày tá tràng: Nghiên cứu thuần tập lớn nhất của Hansson theo dõi
gần 60.000 bệnh nhân Thụy Điển vào viện vì loét dạ dày hoặc loét tá tràng trong
thời gian trung bình 9 năm cho thấy nguy cơ UTDD tăng 1,8 lần ở những bệnh nhân
loét dạ dày lành tính và giảm 0,6 lần ở những bệnh nhân loét tá tràng lành tính [27].
1.1.2. Phân loại ung thư dạ dày
1.1.2.1. Theo vị trí
Hiện nay, người ta có khuynh hướng chia UTDD thành 2 loại là ung thư tâm vị
và ung thư không thuộc tâm vị bởi lẽ dịch tễ, bệnh nguyên, mô bệnh học, điều trị và
tiên lượng của UTDD từ hai vị trí này khác nhau rất rõ [28], [29], [30], [31].
+ Tâm vị: là ung thư trong khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực
quản dạ dày.
+ Không thuộc tâm vị gồm các vị trí sau:
o Phình vị, thân vị
o Bờ cong lớn, bờ cong nhỏ
o Hang, môn vị

không đều, có những vùng loét.
- Týp III (dạng loét): là những tổn thương loét không đều, kích thước thay
đổi, với bờ rõ, cứng, chắc, gồ lên thẳng góc chứ không xuôi như bờ của týp II.
- Týp IV (dạng thâm nhiễm): là những khối u thâm nhiễm lan tỏa hoặc là
những tổn thương dạng xơ đét (linitis plastica). Tổn thương dạng thâm nhiễm lan tỏa
không có giới hạn rõ rệt giữa phần tổn thương và niêm mạc dạ dày bình thường. Ung
thư thể xơ đét là một khối u thâm nhiễm mạnh gồm những tế bào rất ác tính kèm
theo phản ứng tạo xơ rõ rệt làm cho dạ dày cứng, giống như chiếc lọ bằng da (leather
bottle). Ở giai đoạn đầu, ung thư thể xơ đét dễ nhầm với viêm dạ dày.


8

Hình A: Dạng polyp

Hình B: Dạng nấm

Hình C: Dạng loét
Hình D: Dạng thâm nhiễm
Hình 1.3: Phân loại hình ảnh đại thể theo Borrmann
Các thầy thuốc nội soi và phẫu thuật viên thường dùng bảng phân loại này
để mô tả hình ảnh đại thể của khối u vì nó là cách phân loại đơn giản, dễ sử
dụng và cũng có giá trị tiên lượng nhất định trong UTDD.
1.1.2.3. Theo mô bệnh học
Về mặt vi thể, phân loại UTDD rất đa dạng và phức tạp, chủ yếu dựa trên
kiểu hình mô học chiếm ưu thế nhất [35]. Hiện nay, hai cách phân loại đang được áp
dụng nhiều nhất dùng để tiên lượng cho bệnh nhân đó là phân loại của Lauren
(1965) và của WHO (2010).



- Biệt hóa tốt: Cấu trúc tuyến hình dáng rõ ràng, thường giống với biểu
mô ruột dị sản;
- Biệt hóa kém: gồm các tuyến hình dáng không rõ, không đều hoặc thâm
nhiễm gồm các tế bào đơn lẽ hoặc những chuỗi tế bào nhỏ;
- Biệt hóa vừa: có hình ảnh trung gian giữa biệt hóa tốt và biệt hóa kém.
Tiên lượng UTDD biệt hóa kém thường xấu hơn so với UTDD biệt hóa tốt.
Lazăr thấy thời gian sống thêm trung bình của các bệnh nhân UTDD biệt hóa tốt là
60 tháng, biệt hóa vừa là 22,3 tháng và biệt hóa kém là 11,2 tháng và tỷ lệ sống
thêm 5 năm của 3 thể trên lần lượt là 100%, 25% và 7,7% [38].
Tuy nhiên, quan trọng nhất vẫn là độ sâu xâm lấn (giai đoạn T), tình trạng di


10
căn hạch vùng (giai đoạn N) và di căn xa (giai đoạn M) [42]. UTDD càng sớm tiên
lượng càng tốt [3]. Những kết quả này ủng hộ cho sự ra đời phương pháp đánh giá
giai đoạn UTDD dựa trên đánh giá giai đoạn TNM của AJCC/UICC được sử dụng
trên phạm vi toàn thế giới (Bảng 2.2) [31].
Bảng 1.2. Hệ thống đánh giá giai đoạn ung thư dạ dày của Ủy ban Hợp nhất
Hoa Kỳ về Ung thư và Liên minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế lần thứ 7 [31]
Giai đoạn
T
Tis (T0)
T1
T2
T3
T4a
T4b
N
N0
N1

T1N0M0, T2N0M0, T1N1M0
T3N0M0, T2N1M0, T1N2M0, T4aN0M0, T3N1M0, T2N2M0,
T1N3M0
T4aN1M0, T3N2M0, T2N3M0, T4bN0M0, T4bN1M0, T4aN2M0,
T3N3M0, T4bN2M0, T4bN3M0, T4aN3M0
Bất kỳ T, bất kỳ N, M1

1.2. Vị trí, cấu trúc gen và protein MUC1
1.2.1. Vị trí gen
Ở người, gen MUC1 nằm ở nhánh dài nhiễm sắc thể số 1, vùng 2, băng 2
(ký hiệu: 1q22), kích thước 4407 bp, gồm 7 exon và 6 intron.


11

Hình 1.4: Vị trí của gen MUC1 [43]
1.2.2. Cấu trúc gen và các biến thể
MUC1 chứa 7 exon, exon 1-4 mã hóa cho MUC1-N và exon 4-7 mã hóa
MUC1-C (Hình 1.4).

Hình 1.5: Cấu trúc gen MUC1 và các biến thể [44]
Ở người, có một số biến thể của MUC1 là kết quả trong luân chuyển cắt bỏ
exon và nối intron. Một nghiên cứu gần đây xác định được 78 biến thể của MUC1
[45] với các biến thể phổ biến nhất là MUC1/A, MUC1/B, MUC1/C, MUC1/D,
MUC1/X (hoặc MUC1/Z), MUC1/Y, và MUC1/ZD. MUC1/A, MUC1/B, MUC1/C,


12
và MUC1/D mã hóa toàn bộ chiều dài MUC1, qua sự cắt nối intron I và exon 2
(Hình 1.4B), chúng chỉ khác nhau bởi chiều dài VNTR [46] [47]. MUC1/B là được

25 kDa. MUC1-C thiếu N-glycosyl hóa có trọng lượng phân tử 17 kDa.
(C) Trong điều kiện phát triển bình thường, MUC1 vẫn còn ở dạng dị dimer
(giai đoạn 1). MUC1-C chứa một vùng ngoại bào ngắn (53 acid amin), vùng màng
(28 acid amin) và đuôi tế bào chất (72 acid amin). Vùng ECD của MUC1- C được
phân cắt (giai đoạn 2) bởi enzym như yếu tố hoại tử khối u (TNF)- enzym chuyển α


14
(TACE), còn gọi là ADAM17 hay MMP-MT1, để tạo ra các đoạn peptid: MUC1*
(16 kDa) hoặc MUC1-CTF15 (15 kDa) với ECD ngắn hơn. Về chức năng, MUC1*
hoạt động như một thụ thể yếu tố tăng trưởng cho NM23-H1 và MUC1-CTF 15 đóng
vai trò như một chất nền cho γ-secretase.
(D) Trình tự acid amin của MUC1 CT, nổi bật những vị trí tiềm tàng
phosphoryl hóa và gắn các protein. Các tyrosin (màu đỏ), threonin (màu xanh lá
cây) và serine (màu xanh nước biển) của MUC1 CT được phosphoryl hóa bởi thụ
thể yếu tố tăng trưởng và kinase nội bào. Các tiểu đơn vị P85 của PI3K, PKC-δ,
GSK-3β và c-Src phosphoryl hóa gốc tyrosine của trình tự YHPM, threonin của
trình tự TDR, serine của trình tự SPY và tyrosin của trình tự YEKV tương ứng. βcatenin liên kết trực tiếp với các trình tự SAGNGGSSLS giàu serine. Những gốc
được phosphoryl hóa trở thành các vị trí liên kết tiềm năng cho các phân tử tín hiệu
nội bào và do đó có thể tích hợp thác tín hiệu khác nhau hoặc điều chỉnh tình trạng
kích hoạt của chúng. Ví dụ, phosphotyrosin của trình tự SANL hoạt động như một
vị trí bám cho protein Grb-2 [55]. MUC1-C monomer được dimer hóa quanh trình
tự CQC để tạo thành một dimer có chức năng [56].
MUC1-N gồm miền giàu prolin, threonin và serine (PTS) và miền SEA. Tên
miền PTS, cũng chính là trình tự lõi lặp lại (VNTR), được một exon mã hóa rất đa
hình cho nhiều chuỗi 20-21 acid amin lặp đi lặp lại [57].
Ở Bắc Âu, các VNTR gồm 20-120 lần lặp đi lặp lại, với 40-80 lần lặp đi lặp
lại là phổ biến nhất [58]. Trình tự acid amin của vùng VNTR có thể thay đổi trong
các dòng tế bào ung thư khác nhau, phù hợp với tính chất đa hình cao của trình tự
này [59]. MUC1 được O-glycosyl hóa và N-glycosylated rộng rãi tạo nên mucin

năng kháng thuốc chống ung thư.
MUC1 cũng có thể tham gia vào sự di căn vì nó đã được chứng minh in vitro
rằng protein MUC1 có thể liên kết với phân tử bám dính gian bào (ICAM-1), tạo
điều kiện bám dính của các tế bào ung thư vú đến nội mô tế bào, dẫn đến độ bám
dính và di cư tiếp theo thông qua thành mạch [66].
Hơn nữa, MUC1 có thể có một số vai trò trong các tế bào gốc UTDD vì nó
đóng vai trò như một thụ thể yếu tố tăng trưởng trên các tế bào gốc phôi người chưa
biệt hóa và được thể hiện trong các tế bào gốc ung thư bạch cầu dòng tủy cấp tính
[8], [67]. Nó còn giúp tế bào ung thư tồn tại trong điều kiện thiếu oxy và dinh


16
dưỡng bởi điều chỉnh chuyển hóa lipid và đường, trạng thái năng lượng tế bào [68].
1.3. Tính đa hình thái đơn nucleotid của gen MUC 1
1.3.1. Tính đa hình thái đơn nucleotide
Hiện tượng đa hình thái đơn (SNPs) là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi
một nucleotid đơn A, T, G, C ở trong bộ gen bị thay đổi so với bộ gen chung của
loài. Một biến thể để được coi là 1 SNP thì nó phải xảy ra ở ít nhất 1% dân số [69].
SNPs là một hiện tượng tương đối phổ biến diễn ra trong suốt chiều dài DNA
của 1 người, trung bình xảy ra 1 lần sau mỗi 300 nucleotid nghĩa là bộ gen người có
khoảng 3 tỷ bp sẽ có khoảng 10 triệu SNPs. Nó có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào
trên hệ gen, ở vùng mã hóa hay không mã hóa, tuy nhiên người ta tìm thấy SNPs
với tần suất cao ở các đoạn DNA giữa các gen [69], [70].
Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người là giống nhau, nhưng chỉ một
sự thay đổi nhỏ trong hệ gen cũng có thể tác động lớn đến việc làm thế nào mà con
người bị bệnh cũng như khả năng thích nghi với các yếu tố từ môi trường như: chất
độc, vi khuẩn, virus… và đáp ứng với các liệu pháp điều trị. Điều này làm cho
SNPs có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực y sinh học. Tuy vậy, cho đến nay
ứng dụng quan trọng nhất của tính đa hình thái đơn nucleotid là so sánh vùng gen
giữa các nhóm người với nhau để xác định mối liên quan giữa SNPs với sự hình

UTDD

Hàn

lan tỏa

2011

Xu [72]
Jia [73]
Zhang [74]
Palmer [75]
Sun [76]
Zhang [54]
Jia [73]

Trung

Rs407203

304/1465

7,

UTDD

2009

138/241


Quốc

trừ tâm vị

2013

288/281

Ba lan

Nhiễm

2010

320/57

Quốc
Ba lan
Trung
Quốc
Người da
trắng

hình

606/1264

452/372

Quốc

Không
Không
Không