ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN
CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
NGUYÊN PHÁT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN
CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN
NGUYÊN PHÁT

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học Tế bào, các thầy cô trong
khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện và củng cố thêm
rất nhiều kiến thức cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Đồng thời cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn
bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian vừa qua.
Hà Nội, ngày29 tháng 12 năm 2016
Học viên cao học khóa

Trần Đức Tranh

ii


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Sơ lược về ung thư gan nguyên phát .......................................................... 3
1.1.1. Tỷ lệ mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam ................................ 3
1.1.2. Các yếu tố nguy cơ ......................................................................... 4
1.1.3. Lâm sàng và cận lâm sàng của UTGNP ......................................... 6
1.1.4. Điều trị và tiên lượng UTGNP........................................................ 7
1.2. Hệ thống enzym ADH và ALDH và chuyển hóa rượu tại gan .................. 7
1.2.1. Hệ thống enzym ADH và ALDH .................................................... 7
1.2.2. Chuyển hóa rượu tại gan ............................................................... 11
1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan. ................................................. 12
1.3. Sơ lược về gen ALDH2............................................................................ 16
1.3.1. Vị trí và liên quan .......................................................................... 16
1.3.2. Chức năng của gen ALDH2 .......................................................... 16
1.3.3. Tính đa hình của gen ALDH ......................................................... 17


3.3.

Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ khác ................ 47
3.3.1. Gen ALDH2 và độ tuổi phát hiện bệnh UTGNP của các kiểu gen .....47
3.3.2. Mối liên quan của gen ALDH2 với giới tính trong nhóm ung thư
gan nguyên phát ............................................................................ 48
3.3.3. Mối liên quan của gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu. ...... 49
3.3.4. Mối liên quan của gen ALDH2 vớí nhiễm virut HBV ................. 50

KẾT LUẬN .................................................................................................... 52
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Mô hình của enzym ADH ............................................................. 8

Hình 1.2.

Chuyển hóa rượu ở gan và vai trò hình thành ung thư gan ........ 15

Hình 1.3.


Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym
MboII trên mẫu đối chứng. ........................................................ 42

Hình 3.5.

Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym
MboII trên mẫu của bệnh nhân UTGNP. ................................... 43

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các isoenzym ADH ở người .......................................................... 9
Bảng 1.2. Vị trí cắt của một số enzym giới hạn ............................................. 24
Bảng 3.1. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu ........................................ 35
Bảng 3.2. Đặc điểm giới của nhóm nghiên cứu ............................................. 36
Bảng 3.3. So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu trên thế
giới và Việt Nam ........................................................................... 37
Bảng 3.4. Đặc điểm mắc viêm gan B và uống rượu của nhóm UTGNP ....... 37
Bảng 3.5. Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA ................... 39
Bảng 3.6. Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 và alen của 2 nhóm .................................. 44
Bảng 3.7. Tỷ lệ kiểu gen, alen ALDH2 của 2 nhóm và nguy cơ mắc UTGNP 45
Bảng 3.8. Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 kết hợp của 2 nhóm và nguy cơ mắc
UTGNP .......................................................................................... 46
Bảng 3.9. Trung vịtuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen ALDH2................. 47
Bảng 3.10. Gen ALDH2 và giới trong nhóm bệnh ......................................... 48
Bảng 3.11. Gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu .................................... 49
Bảng 3.12. Gen ALDH2 với tình trạng nhiễm virus viêm gan B ................... 50



: Deoxyadenosine triphosphate

T

: Thymidine triphosphate

G

: Deoxyguanosine triphosphate

C

: Deoxycytidine triphosphate

OD

: Optical Density (Độ hấp thụ quang)

OR

: Odds ratio
(Tỷ suất chênh = tỷ số giữa nguy cơ mắc bệnh và không mắc bệnh)

PCR

: Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuyếch đại gene)

RFLP


Pro

Proline

Arg

Arginine

His

Histidine

Ser

Serine

Asn

Asparagine

Ile

Isoleucine

Thr

Threonine

Asp


Val

Valine

Glu

Glutamic acid

Phe

Phenylalanine

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiện rượu là một trong những nguy cơ gây ung thư gan cao. Khi rượu vào
cơ thể, ethanol sẽ được chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là chất gây độc
và làm hủy hoại tế bào gan. Acetaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với DNA
tạo sản phẩm DNA “adduct” làm cho khối u phát triển [61], [38], [65], [29], [16].
Sự chuyển hoá ethanol tại gan được xúc tác bởi enzym alcohol dehydrogenase
(ADH). Tiếp đó, acetaldehyde đi vào ty thể, được oxy hoá thành acetat bởi một
trong những enzym aldehyde dehydrogenase (ALDH). ALDH có tác dụng oxy hóa
hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol
[25], [5], [71], [24], [22].
ALDH gồm nhiều isoenzym trong đó có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm
thấy trong bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2,
enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2. Gen ALDH2 là loại gen
đa hình được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả. Các nghiên cứu trên thế giới đã

2.

Khảo sát mối liên quan giữa gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ hay gặp
trênbệnh nhân ung gan nguyên phát.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về ung thƣ gan nguyên phát
1.1.1. Tình hình mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam
Ung thư gan nguyên phát là loại ung thư phát sinh từ các tế bào trong gan và
thường là chính từ tế bào gan. UTGNP là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến
nhất trên thế giới, bệnh thường phát hiện muộn, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong
cao, thời gian sống của người bệnh kể từ thời điểm phát hiện bệnh ngắn. Theo công
bố Globocan năm 2012, trên toàn thế giới có tới 782.000 bệnh nhân mới được chẩn
đoán và 746.000 người tử vong do loại ung thư này. Khi xét riêng theo giới,
UTGNP là loại ung thư đứng hàng thứ 5 ở nam giới và đứng hàng thứ 9 ở nữ giới
vè tỷ lệ mắc, trong đó đại đa số là ung thư biểu mô tế bào gan [39].
Tuy nhiên tỷ lệ mắc UTGNP khác nhau tùy theo từng khu vực địa lý trên thế giới.
Vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao tức là từ 30 trường hợp/100.000 dân/1 năm trở lên gồm
khu vực Đông Á đặc biệt là Trung Quốc, Đông Nam Á và châu Phi (trừ Bắc Phi).
Vùng có tỷ lệ mắc bệnh trung bình là từ 3-30 trường hợp/100000 dân/1 năm như
khu vực Nam Âu, Bắc Phi, Ấn Độ, Nhật Bản.Vùng có tỷ lệ mắc bệnh thấp là
HCV có thể làm tăng tỷ lệ mắc ung thư gan [5].
- Rượu
Rượu là yếu tố nguy cơ quan trọng trong UTGNP. Tuy rượu không có tác
dụng gây ung thư trực tiếp nhưng vai trò độc hại của việc sử dụng rượu kéo dài nhiều
năm đã được chứng minh là có liên quan chặt chẽ đến nhiều loại hình ung thư [35].
Uống rượu kéo dài nhiều năm sẽ gây nguy cơ xơ gan và là cơ sở chắc chắn gây
UTGNP, thực tế phần lớn UTGNP phát triển trên nền gan xơ. Ở California, một
nghiên cứu trên những người nghiện rượu cho thấy nguy cơ UTGNP tăng lên gấp 4
lần ở người uống rượu nhiều >80g/ngày [17]. Ở nghiên cứu khác trên bệnh xơ gan
cho thấy nguy cơ UTGNP cao gấp 13 lần ở những người uống rượu nhiều so với

4


những người không uống rượu [53]. Ngoài số lượng rượu uống, thì thói quen
uống rượu cũng gây tăng tỷ lệ bệnh gan do rượu. Người ta nhận thấy cùng lượng
rượu nếu tỷ lệ sử dụng rượu vang cao thì nguy cơ mắc bệnh gan thấp hơn uống
rượu bia bình thường.
Mặc dù ung thư gan nguyên phát gặp ở nam giới nhiều hơn nữ giới nhưng
những trường hợp phụ nữ cùng uống lượng rượu như nam giới có nguy cơ mắc
bệnh về gan lại cao hơn nam giới. Một số tác giả cho rằng enzym ADH ở dạ dày ở
nữ thấp hơn nam giới, nhưng điều này còn chưa có bằng chứng thuyết phục và còn
được các nhà nghiên cứu đang tìm hiểu thêm. Hiện nay, các giả thuyết nghiêng về
estrogen làm tăng nhạy cảm với nội độc tố từ ruột và gây bệnh gan. Bởi vậy ngưỡng
nguy hiểm ở nam giới thường được xem là khoàng 40g/ngày còn ở phụ nữ chỉ là
20g/ngày [5], [4]. Ngoài ra, nghiên cứu ở Mỹ cho thấy những người nguồn gốc Tây
Ban Nha có nguy cơ mắc bệnh gan do rượu cao hơn người Mỹ da đen và da trắng.
Các bệnh lý phối hợp: viêm gan B, C,tình trạng rối loạn chuyển hóa, béo phì, đái
tháo đường… làm tăng cảm thụ với tổn thương gan do rượu do đó làm hạ ngưỡng nguy
cơ của rượu [34], [49].

lượng AFP huyết thanh có liên quan chặt chẽ đến độ biệt hóa của tế bào ung thư và
kích thước khối u. Đối với bệnh nhân UTGNP có khối u
gan. ADH1A xuất hiện trong những ngày đầu của bào thai, và hoạt tính enzym này
kém trong thời kỳ thai nghén và thời kỳ trưởng thành, trong khi đó ADH1B và
ADH1C có tổng hoạt enzym tính mạnh nhất trong nhóm. ADH4 liên quan ít đến
oxy hóa ethanol, có nhiều ở gan, nhưng nồng độ thấp ở dạ dày, tụy và ruột non.
ADH5 có mặt mọi mô trong cơ thể, nhưng oxy hóa ethanol kém. ADH6có ở gan, dạ
dày, chức năng chuyển hóa ethanol hiện nay vẫn chưa biết rõ. ADH7 có nhiều ở dạ
dày và đường tiêu hóa trên, tham gia chuyển hóa ethanol [25], [24], [71].

8


Bảng 1.1. Các isoenzym ADH ở người [41].
Sai khác acid

Danh pháp gen
Nhóm

I

Mới

Cổ điển

ADH1A

ADH1

Protein

alen

Gln272,Val350

ADH1C*2 ADH3*2

Mô

amin giữa các

Gan, Phổi

Gan, Dạ dày

II

ADH4

ADH4

Π

Gan

III

ADH5

ADH5

Χ


exon. Thêm vào đó, các protein tương ứng của 2 gen này có trình tự giống nhau tới
70% và cấu trúc không gian cũng tương tự nhau [64]. Có lẽ, gen ALDH2 được mã

9


hóa bởi gen đa hình thái được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả. Các nghiên cứu
trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn mã hóa cho enzym
ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [70], [69], [14], [19].
ALDH2*2 là do sự thay thế glutamate bằng lysine ở vị trí acid amin 504. Hậu
quả dẫn đến sự tạo thành enzyme ALDH2 gần như mất hoạt tính oxy hoá
acetaldehyde thành acetate. Các nghiên cứu dịch chiết gan cho thấy alen ALDH2*2
trội so với alen ALDH2*1 (những người mang một alen ALDH2*2và một alen
ALDH2*1, dạng dị hợp tử) cũng không phát hiện thấy hoạt tính của enzyme ALDH
[23]. Các nghiên cứu tạo dòng các alen này trên tế bào nuôi cấy cũng thu được kết
quả tương tự [55].
Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều
Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi [32], [64], [67].
Những người mang alen ALDH2*2 lượng acetaldehyde trong máu tăng từ mức
gần như không phát hiện được tới mức cao và gây nên các phản ứng bao gồm nôn
nặng, buồn nôn, nhịp tim nhanh và các phản ứng như khi dùng các thuốc điều trị
nghiện rượu. Một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống tình trạng phụ
thuộc rượu khi có mặt alen ALDH2*2[15], [64].
Nghiên cứu tiến hành so sánh 2 nhóm nam giới Trung Quốc, một nhóm mang
2 alen hoạt động ALDH2*1 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1 , một
nhóm mang 1 alen bất hoạt ALDH2*2 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1.
Kết quả cho thấy OR của người nghiện rượu giữa 2 nhóm là 0,33. Nếu có thêm alen
ALDH2*2, người đó mang ít nhất 1 alen tăng hoạt động ADH1B*2, thì OR còn
giảm xuống 0,05.
Ở người đồng hợp tử ALDH2*2, tác động của lượng nhỏ rượu cũng rất nặng nề.

gan. Quá trình chuyển hóa tại gan có 2 con đường là oxy hóa và không oxy hóa.
Quá trình oxy hóa ethanol tại gan gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn chuyển từ ethanol thành acetaladehyde:
Có 3 loại enzym tham gia giai đoạn này
 Enzym ADH có tác dụng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, vận chuyển
proton H+gắn với coenzym NAD+ thành NADH. ADH hoạt động trong bào tương tế
bào gan.

11


 Enzym Cytochrome P450 2E1 của gan, tham gia chuyển hóa ethanol thành
aldehyd và NADPH thành NADP+
 Enzym Catalase có mọi nơi trong cơ thể tham gia chuyển hóa ethanol thành
aldehyde và giải phóng O2 từ H2O2 tạo thành H2O. Enzym tham gia chuyển hóa
rượu ở não liên quan đến dẫn truyền thần kinh.

- Giai đoạn chuyển hóa từ acetaldehyde thành acetate
Tham gia phản ứng này là enzymacetaldehyde dehydrogenase với vai trò
chuyển aldehyde thành acetate và H+sẽ được gắn với NAD+tạo thành NADH.
Enzym này hoạt động trong ty thể và được tìm thấy trong tế bào ở nhiều cơ quan
khác nhau trong đó nhiều nhất là ở tế bào gan [25], [24], [71]. Khi acetate được tạo
thành thì thường thoát khỏi tế bào gan vào máu và đi vào chu trình Krebs ở các cơ
quan

khác

và


ra NADH sẽ tiếp tục tham gia vào vận chuyển electron trong ty thể hoặc chuỗi hô
hấp tế bào. Để đáp ứng quá trình vận chuyển electrons, tế bào gan cần lượng oxy
nhiều hơn mức bình thường. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuyển hóa rượu có xu
hướng làm tăng hấp thụ oxy từ máu của tế bào gan. Tiêu thụ rượu mãn tính gây
thiếu oxy đến gan làm tổn thương tế bào gan. Ngoài ra, ethanol gián tiếp gây tăng
sử dụng oxy do hoạt hóatế bào Kuffer ở gan, làm tình trạng thiếu oxy tại tế bào gan
trở nên trầm trọng hơn. Khi các tế bào này bị hoạt hóa, chúng giải phóng phân

12


tửnhư prostaglandin E2… gây kích thích một loạt các phản ứng khác đòi hỏi tiêu
thụ nhiều oxy hơn tại gan [71].
- Hình thành chất độc.
Chuyển hóa ethanol với sự xúc tác ADH và CYP2E1 hình thành acetaldehyde
và ROS tương tác protein và các phân tử khác hình thành chất độc bền vững và
không bền vững. Acetaldehyde là chất độc gây đột biến gen và ung thư,
Acetaldehyde gắn với DNA hình thành “DNA adduct”. Vai trò của Acetaldehyde
gây ung thư do rượu có liên quan đến di truyền. Hiện tượng đa hình thái hoặc biến
đổi gen mã hóa có liên quan đến tăng hay giảm nồng độ AA [61].
+Acetaldehyde“adducts”
Acetaldehyde “adducts” (AA) là cấu trúc màu acetaldehyde gắn với các
protein như protein ở màng hồng cầu, lipoprotein, hemoglobin, albumin, collagen
và tubulin. AA có thể kết hợp tubulin làm ngăn cản quá trình hình thành vi ống và
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào cũng như vận chuyển nội bào hay protein qua
màng tế bào [71]. AA kết hợp với collagen, một protein có vai trò quan trọng trong
kết nối các mô và kích thích quá trình sinh tổng hợp collagen trong các tế bào hình
sao của gan, đây là bước quan trọng trong quá trình hình thành sẹo trong gan, và xơ
gan [38].
Acetaldehyde tương tác với các acid amin (cystein, lysine, acid amin nhân

Hình 1.2. Chuyển hóa rƣợu ở gan và vai trò hình thành ung thƣ gan
Alcohol được chuyển hóa thành acetaldehyde dưới tác dụng của enzym ADH
và cytochrom P4502E1, acetaldehyde gắn với DNA tạo thành “DNA adduct” và
gắn protein tạo thành sản phẩm gây độc cho cơ thể, có thể hình thành ung thư.
Enzym ALDH chuyển acetaldehyde thành sản phẩm không độc là acetate, chất này
đi vào chu trình Krebs. Quá trình chuyển hóa ethanol hình thành ROS tạo ra chất
MDA-4HNE có thể gắn DNA tạo “DNA adduct”, chất này tạo ra có thể hình thành ung
thư gan.

15