BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG TUYẾT HẠNH

NGHI£N CøU §A H×NH §¥N NUCLEOTID
RS861539
CñA GEN XRCC3 TR£N BÖNH NH¢N UNG
TH¦ Vó

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC


HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG TUYẾT HẠNH

NGHI£N CøU §A H×NH §¥N NUCLEOTID
RS861539
CñA GEN XRCC3 TR£N BÖNH NH¢N UNG
TH¦ Vó

EGFR

Epidermal Growth Factor Receptor
(Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu mô)
Estrogen receptor (Thụ thể estrogen)
Guanosine
Holliday junction (Mối giao Holliday)
Homologous Recombination (Tái tổ hợp tương đồng)
Nhiễm sắc thể
Optical density (Độ hấp thụ quang)
Odds ratio (Tỷ suất chênh)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)
Progesterone receptor (Thụ thể progesterone)
Restriction fragment length polymorphism
(Hiện tượng đa hình chiều dài của các đoạn DNA do enzym giới hạn

ER
G
HJ
HR
NST
OD
OR
PCR
PR
RFLP

SNP
T
UT

1.2.4. Tính đa hình thái đơn nucleotid.....................................................19
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đa hình đơn nucleotid...........23
1.3.1. Kỹ thuật PCR.................................................................................23
1.3.2. Kỹ thuật RFLP-PCR......................................................................24
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen...............................................................25
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............29
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................29
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................29
2.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................29
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng.........................................31
2.4.1. Dụng cụ..........................................................................................31
2.4.2. Trang thiết bị..................................................................................31
2.4.3. Hóa chất.........................................................................................31
2.5. Quy trình kỹ thuật.................................................................................33
2.5.1. Quy trình lấy mẫu..........................................................................33
2.5.2. Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch........33
2.5.3. Quy trình khuếch đại gen và điện di kiểm tra sản phẩm................36


2.5.4. Quy trình cắt enzym và điện di kiểm tra sản phẩm........................37
2.5.5. Quy trình giải trình tự gen.............................................................38
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu....................................................................40
Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................41
3.1. Kết quả phân bố đa hình đơn nucleotid rs861539 của gen XRCC3 trên
nhóm bệnh và nhóm chứng...............................................................41
3.2. Kết quả mối liên quan giữa đa hình đơn nucleotid rs861539 và nguy cơ
mắc UTV...........................................................................................42
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN...............................................................43
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................................44
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ.................................................................................44

Tần số alen SNP rs861539 trên nhóm bệnh và nhóm chứng........41
Liên quan giữa SNP rs861539 và nguy cơ mắc UTV...................42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Phân bố tỷ lệ mắc UTV trên thế giới............................................3

Hình 1.2.

Phân bố tỷ lệ tử vong do UTV trên thế giới..................................4

Hình 1.3.

Vị trí gen XRCC3 trên NST số 14..............................................16

Hình 1.4.

Cơ chế sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA.......................................17

Hình 1.5.

Minh họa cấu trúc Holliday junction.........................................18

Hình 1.6.

Minh họa hiện tượng đa hình đơn nucleotid...............................20



đó, mặc dù có tỉ lệ mắc bệnh thấp nhưng tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân ung thư vú
tại Việt Nam lại cao hơn so với các nước phát triển; và do đó cũng cho thấy
rằng việc tìm kiếm các phương pháp chẩn đoán mới và đầy đủ hơn cho ung
thư vú ở người Việt Nam là hết sức cần thiết. Có rất nhiều yếu tố đã được xác
định có liên quan đến sự hình thành và phát triển của ung thư vú như yếu tố
tuổi tác, giới tính, lối sống, môi trường,… Trong số đó, mặc dù chỉ chiếm từ 5
– 10 % số trường hợp mắc ung thư vú [6] nhưng yếu tố di truyền lại có thể
được sử dụng cho việc chẩn đoán và phát hiện bệnh từ rất sớm, góp phần
giảm tỉ lệ tử vong và định hướng cho các điều trị trúng đích..
Những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
các nhà khoa học đã phát hiện ra gen XRCC3 nằm trên NST 14q32.3 là một
trong những gen sửa chữa DNA quan trọng nhất. Hơn nữa, gen XRCC3 có
cấu trúc và chức năng liên quan đến RAD51 có vai trò quan trọng trong quá
trình tái tổ hợp tương đồng - một quá trình sửa chữa DNA, nếu bị lỗi có thể


2

dẫn tới sự hình thành và phát triển ung thư [7]. Bất kỳ khiếm khuyết nào trong
hoạt động của XRCC3 có thể dẫn tới không đảm bảo chức năng trong quá
trình sửa chữa DNA. Do đó, đa hình đơn nucleotid (SNP – Single Nucleotide
Polymorphism) là mục tiêu tiềm năng lớn trong các nghiên cứu về ung thư,
trong đó có ung thư vú [8]. Một trong số những SNP nhạy cảm với ung thư vú
đang thu hút sự chú ý rộng rãi là rs861539 của gen XRCC3. Trên thế giới đã
có nhiều nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa đa hình đơn nucleotid
rs861539 của gen XRCC3 với nguy cơ mắc bệnh ung thư vú. Tuy nhiên, trên
những chủng tộc người khác nhau, các nhà khoa học thu được kết quả trái
chiều [9]. Tại Việt Nam cũng chưa có một công trình nào được tiến hành. Từ
thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa hình đơn nucleotid
rs861539 của gen XRCC3 trên bệnh nhân ung thư vú” với hai mục tiêu:


4

Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi giữa các vùng miền trên thế giới với tỷ lệ mắc
cao nhất là ở Tây Âu (96/100.000), Bắc Mỹ (92/100.000), còn tỷ lệ thấp nhất
ở Trung Phi (27/100.000) và Nam Trung Á (28/100.000) [10].

Hình 1.2. Phân bố tỷ lệ tử vong do UTV trên thế giới
(Nguồn: )
Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50
thế kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong các năm
qua như Nhật Bản, Singapore, một số thành phố của Trung Quốc… Sự gia
tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở các vùng này phần nào được giải thích do sự
thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển, ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc
trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế
độ ăn… Tỷ lệ mắc UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30 (khoảng
0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách nhanh chóng
(khoảng 6,5% ở tuổi 30-40). Theo thống kê của hiệp hội phòng chống UT
Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-34 lên đến
200/100.000 dân ở độ tuổi từ 45-49 [11]. Tuy nhiên ở một số nước phát triển
mặc dù tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở
mức ổn định nhờ các tiến bộ sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thanh tựu
đạt được trong điều trị.


5

1.1.2.2. Tình hình UTV tại Việt Nam
Theo Trung tâm y học hạt nhân và ung bướu bệnh viện Bạch Mai ghi
nhận ung thư ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh trong nhiều

hormon này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển UTV. Mãn kinh
muộn sau tuổi 55 và mãn kinh muộn một năm tỷ lệ UTV tăng 3%. Phụ nữ chưa
mang thai nguy cơ mắc UTV cao gấp 1,4 lần so với phụ nữ có mang thai. Phụ
nữ sinh con lần đầu càng sớm thì nguy cơ mắc UTV càng thấp và tỉ lệ này tăng
3% cho mỗi năm chậm sinh con lần đầu. Sinh con sau tuổi 30 nguy cơ bị UTV
cao gấp từ 2-5 lần so với nhóm sinh con trước tuổi 19.
- Chế độ dinh dưỡng
Béo phì ở lứa tuổi sau mãn kinh, rượu, bia được coi làm tăng nguy cơ
UTV. Ngược lại chế độ ăn nhiều dầu oliu, ngũ cốc và hoa quả có thể làm giảm
nguy cơ này.
- Các yếu tố môi trường
Khi tiếp xúc với những bức xạ ion hoá làm tăng nguy cơ phát triển
UTV, có mối liên quan giữa liều lượng, tuổi tiếp xúc bức xạ ion với nguy cơ
bị UTV [13].
1.1.4. Tiến triển UTV
Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau
giữa các bệnh nhân. Người ta ước tính, từ khi tế bào chuyển biến ác tính đầu
tiên đến khi phát hiện được khối u có kích thước 1cm thì phải mất khoảng
thời gian vài năm. Chỉ một số ít bệnh nhân (
8

T: U nguyên phát
Tx: Không xác định được u nguyên phát.
T0: Không có dấu hiệu u nguyên phát.
Tis: UTBM tại chỗ: UTBM nội ống, UTBM tiểu thuỳ tại chỗ, bệnh
Paget núm vú không có u.
T1: U có đường kính ≤ 2cm
T2: 2 < đường kính u ≤ 5cm
T3: U có đường kính > 5cm
T4: U xâm lấn trực tiếp tới thành ngực hoặc da bất kể kích thước
(thành ngực gồm xương sườn, cơ gian sườn, cơ răng trước, không tính cơ
ngực lớn).
T4a: U xâm lấn tới thành ngực.
T4b: Thâm nhiễm sần da cam, loét da vú hoặc có nhiều u nhỏ dạng vệ
tinh ở vú cùng bên.
T4c: Bao gồm cả T4a và T4b.
T4d: UTV dạng viêm.
N: Hạch vùng
Nx: Không xác định được hạch vùng.
N0: Không di căn hạch vùng.
N1: Di căn hạch nách cùng bên di động.
N2: Di căn hạch nách cùng bên nhưng hạch dính vào nhau hoặc dính
vào mô xung quanh hoặc lâm sàng có di căn hạch vú trong cùng bên nhưng
không có di căn hạch nách:
N2a: Di căn hạch nách cùng bên nhưng hạch dính vào nhau hoặc dính
vào mô xung quanh.
N2b: Lâm sàng có di căn hạch vú trong cùng bên nhưng không có di
căn hạch nách.



T0,1

N1

M0;

T2

N0

M0

Giai đoạn IIB:

T2

N1

M0;

T3

N0

M0

Giai đoạn IIIA:

T0,1,2


1.1.5.3. Chẩn đoán mô bệnh học
Carcinom chiếm khoảng 90% trong đó:
- Carcinom ống tuyến xâm nhập : 78%
- Carcinom tiểu thuỳ

: 9%

- Carcinom dạng tuỷ

: 1,5%

- Carcinom dạng kéo

: 1,5%

- Sarcom, paget không xếp loại nhưng bệnh paget có khối u được phân
loại theo kích thước u.
1.1.6. Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV
Các quyết định trong điều trị bổ trợ UTV được dựa vào các yếu tố tiên
lượng. Bên cạnh việc đánh giá các yếu tố tiên lượng kinh điển như kích thước


10

u, loại mô học, độ mô học, tình trạng hạch nách, các nhà nghiên cứu đang có
xu hướng đi sâu về bệnh học phân tử và gen để tìm ra bản chất phát triển của
khối u nhằm đưa ra một phương thức điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân.
1.1.6.1. Hạch vùng
Hạch nách: Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan

6,3%, tỷ lệ sống thêm sau 5 năm là 82% [17][19].
1.1.6.6. Độ mô học
Độ mô học là một yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù nó không sử
dụng để đánh giá giai đoạn bệnh. Độ mô học dựa vào sự hình thành ống nhỏ,
sự đa hình thái của nhân và hoạt động nhân chia.
1.1.6.7. Tỷ lệ sống theo giai đoạn
Bảng 1.1. Tỷ lệ sống thêm theo giai đoạn
Giai đoạn
0
I
II
III
IV

Tỷ lệ sống 5 năm (%)
100
87
68
41
10

Tỷ lệ sống 10 năm (%)
100
78
52
28
0

1.1.7. Điều trị UTV
Cho tới nay, việc nghiên cứu điều trị UTV vẫn đang được tiếp tục và

người bình thường và tăng cao trong một số loại UT. CEA được coi là một
dấu ấn đặc hiệu cho UT đại tràng, tuy nhiên CEA còn thấy tăng cao trong
UTV, đường tiêu hoá, phổi, buồng trứng, tuỵ và tuyến tiền liệt. Hơn nữa nó
cũng tăng lên ở người nghiện rượu, viêm ruột, xơ hoá bàng quang và ở những
người hút thuốc lá nặng. Mặc dù CEA không đặc hiệu cho chẩn đoán, nhưng
có giá trị tiên lượng và theo dõi điều trị. Nồng độ CEA cao sau điều trị là cơ
sở nghĩ đến sự tiến triển của khối u hay di căn.


13

- CA 15-3 (Carbohydrat Antigen) bản chất là một glycoprotein không
đặc hiệu nhưng nhạy cảm với UTV. Bình thường có trong huyết thanh người
với nồng độ < 25 U/ml, CA 15-3 tăng trong 10% phụ nữ mắc bệnh UTV và
tăng trong 70% những người mắc UTV di căn. Do vậy CA 15-3 thường được
sử dụng để sàng lọc, theo dõi điều trị và phát hiện tái phát UTV sau giai đoạn
điều trị.
1.1.8.2. Dấu ấn là enzym
Các xét nghiệm về enzym huyết thanh để chẩn đoán UT thường có độ
đặc hiệu kém do vậy hiện nay rất ít được sử dụng trong chẩn đoán. Enzym
CK-BB là enzym được sử dụng trong chẩn đoán UTV. Tuy nhiên để chẩn
đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa.
- Creatine kinase: Isoenzym creatine kinase BB (CK- BB) có trong
huyết thanh có nguồn gốc từ não và có liên quan đến nhiều bệnh UT ác tính.
CK- BB huyết thanh tăng ở một số bệnh UT ác tính như: UTV, UT buồng
trứng, UT não, UT phổi,… Isoenzym CK- BB được phát hiện và định lượng
nhờ điện di. Tuy nhiên CK-BB trong huyết thanh không đặc hiệu.
1.1.8.3. Dấu ấn là các receptor
Rất nhiều khối u ác tính gây những biến đổi về chức năng và số lượng
receptor nên các receptor có thể được sử dụng như là dấu ấn UT. Các dấu ấn

thì chúng được gọi là gen gây UT. Sự biểu hiện quá mức gây hậu quả như sự
tăng sinh tế bào và gây ác tính. Tới nay rất nhiều gen gây UT đã được xác
định có liên quan với nhiều loại UT, trong đó có UTV. Đầu thập kỷ 90, bắt
đầu có các chương trình nghiên cứu về gen được tiến hành, trong đó có 3 gen
được tập trung nghiên cứu và có khả năng liên quan nhiều đến UTV là
BRCA1 (breast cancer 1), BRCA2 và p53.
- Gen BRCA1 nằm trên nhánh dài NST 17 là gen ức chế tạo u, có chức
năng ngăn ngừa sự phát triển và phân chia nhanh chóng hoặc không kiểm soát
được của các tế bào. Mặt khác, gen BRCA1 còn sản sinh ra một loại protein


15

tham ra trực tiếp vào việc sửa chữa trong quá trình tái bản DNA., một số
nghiên cứu cho rằng có khoảng 80-90% gặp đột biến gen này và gặp ở những
gia đình có UTV.
- Gen BRCA2 nằm trên nhánh dài NST 13, có vai trò giống gen
BRCA1, có chức năng kìm hãm sự phát triển khối u, sửa chữa DNA trong quá
trình tái bản. Gen BRCA2 chiếm khoảng 35-40% UTV mang tính di truyền và
đã tìm thấy trong những gia đình bị UTV.
- Gen p53 là gen ức chế khối u nằm trên nhánh ngắn NST 17 tham gia
vào quá trình điều hoà chu kỳ tễ bào và ức chế sự chết theo chương trình của
tế bào (appotosis). Đột biến gen p53 gây hậu quả ác tính ở rất nhiều UT, trong
đó có UTV.
- Gen HER2 nằm trên NST 17, sự khuếch đại gen này dẫn đến sự tăng
biểu hiện thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào UTV. Biểu hiện quá mức HER2 có
thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u.
Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân UTV có sự
khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào UT.
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa