HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN VĂN NÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH
CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC
PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC
TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số: 62.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Hà Nội - Năm 2017


Công trình được hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN
2. PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH

Phản biện 1: PGS TS. PHẠM VĂN HOẠT
BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
Phản biện 2: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH
TRUNG TÂM CHUẨN ĐOÁN THÚ Y TRUNG ƢƠNG
Phản biện 3: TS. ĐẶNG THANH SƠN
VIỆN THÚ Y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại

ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo,
hải cẩu) (Murphy et al., 1999). Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang
dã ăn thịt và hổ (Appel et al., 1994); (Frölich et al., 2000); (Martella et al.,
2002). Virus Care có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm
khoảng 15.690 nucleotide. Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các
protein như protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H),
yếu tố kết hợp virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan
tới sự sao chép RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid
N đóng gói RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein
Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã
phân loại virus Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like,
America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife.
CDV là virus gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Trước
đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các môi trường như
dòng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al.,
1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng
chồn sương (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập
và xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do không có dòng tế bào nào thích
hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào. Qua nghiên cứu của Seki et al.
(2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có
thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus.
Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920. Chó phát bệnh
thường chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu không được điều
1


trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các
tỉnh và gây thiệt hại lớn cho đàn chó nuôi trong nước do tỷ lệ tử vong của bệnh
rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Nhưng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học
và di truyền của virus Care ở trong nước còn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu

lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus
phân lập được từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh
phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên
cứu về bệnh Care ở chó trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y.
Đây cũng là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công
2


tác thú y cơ sở về bệnh Care. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống
virus Care phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ
chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng
bảo tồn nguồn gene quốc gia.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học
phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt
Nam. 5 chủng virus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất
vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để
công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả
nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin
trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao
hiệu quả phòng bệnh.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI
NƢỚC
2.1.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc
Nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care được
thực hiện bởi các tác giả như: Hồ Đình Chúc (1993); Lê Thị Tài (2006); Tô Du

đường kính đo được 115nm đến 230nm. Màng cuộn kép có độ dày 75 đến 85Ao
với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989).
2.2.3. Cấu trúc của virus Care
Virus Care không phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA ước
chừng khoảng 15,7 Kb và có vỏ bọc với đường kính có kích thước từ 150 tới
300 nm (Murphy et al., 1999).
2.2.4. Sức đề kháng của virus Care
Virus Care là một virus không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV,
dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Gröne et al., 1998) mặc
dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài.
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh
Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho, niêm mạc và
mô thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp. Sau đó
virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus tác động
đến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo máu vào
hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như
dây thần kinh thị giác. Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng
hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng.
2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care
Nghiên cứu của Seki et al., (2003) đã làm rõ những đặc tính sinh trưởng
khác nhau khi gây nhiễm các CDV lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST. Qua đó,
có thể nhận thấy, tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để
phân lập và xác định hiệu giá virus (Lan et al., 2005a; 2005b; 2006b).
2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care
Cấu trúc của virus Care gồm 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein
cấu trúc gồm: Large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P),
nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M). (Diallo,
1990). Phân loại theo địa lý của virus Care dựa trên trình tự của protein H
(Harder and Osterhaus, 1997) gồm 7 nhóm chính: Arctic – like, America 1,
America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Bệnh viện thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016
3.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các mẫu bệnh
phẩm của chó mắc bệnh Care được thu thập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam:
Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Dụng cụ, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Bể ổn nhiệt, máy đúc
chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính
hiển vi quang học, máy xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm
nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR,
máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000.
5


- Hóa chất phục vụ nghiên cứu: Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm
Hematoxilin – Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch
đệm EDTA, kháng sinh; kit tách chiết RNA, DNA tổng số, cặp mồi gene H và
P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh
sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene, kit ELISA.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care
- Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care

vào lúc 7 giờ sáng và 5 giờ chiều. Tần số hô hấp được kiểm tra bằng phương
pháp quan sát, thông qua sự lên xuống của các cơ vùng ngực. Tần số tim được
đo bằng ống nghe đếm nhịp tim trong một phút.
6


3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể
Chó bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám nhằm
bộc lộ các cơ quan trong xoang ngực, xoang bụng, xoang chậu, hộp sọ và não,…
để quan sát.
3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin,
nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn
Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm đúc bằng
paraffin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Các bước thực hiện chính gồm:
làm sạch tiêu bản; hoạt hóa enzyme; khử peroxydase nội sinh; gắn kháng thể;
gắn kháng kháng thể; bổ sung cơ chất; nhuộm nhân tế bào và đọc kết quả.
3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu
Lấy 2ml máu/con, đưa vào ống bảo quản có chứa chất chống đông, sau đó
phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu bằng máy đếm huyết học Cell-Dyn 3700.
3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào Vero-DST được nuôi cấy trên môi trường DMEM có bổ
sung 10% FCS và 5% CO2.
3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST
Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được
đồng nhất trong dung dịch MEM. Tiến hành ly tâm tốc độ cao và lọc hỗn dịch
bệnh phẩm. Hút bỏ môi trường nuôi cấy ở các đĩa lồng tế bào đã chuẩn bị và bổ
sung 100 µl hỗn dịch bệnh phẩm. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 370C với

3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR, chạy phản ứng PCR
sequence rồi tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR sequence, sau đó đưa vào máy
giải trình tự gene tự động Beckman Coulter SEQ 8000. Dữ liệu các trình tự
gene thu được trên máy giải trình tự gene được kiểm tra bằng chương trình
Blast trên ngân hàng gene thế giới. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng
loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx
(version 5.0.4) và MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version
6.0. Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000
đơn vị với các chủng tham chiếu được lấy từ ngân hàng gene thế giới.
3.5.14. Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được gồm thân nhiệt, tần số hô hấp, tần số tim và các
chỉ tiêu máu được tính toán các giá trị trung bình (Mean) và sai số chuẩn (SE)
bằng phần mềm Minitab version 16.2.4. Sử dụng phương pháp thống kê phân
tích phương sai (ANOVA/One Way) với phương pháp Tukey của phần mềm
Mintab version 16.2.4 nhằm chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các số
liệu thu thập được.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA
CHÓ MẮC BỆNH CARE
4.1.1. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR
Nghiên cứu đã tiến hành lấy dịch swab của 68 chó trong nghiên cứu để
chẩn đoán bằng RT-PCR (với bệnh Care) và PCR (với bệnh Parvovirrus) nhằm
sàng lọc được các chó chỉ mắc bệnh Care. Kết quả chẩn đoán bằng phương
pháp RT-PCR và PCR được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR và PCR
Parvovirus
CDV
Mẫu bệnh phẩm
Dịch swab

68
68
100,0
2
Sốt
68
68
100,0
3
Dử mắt
68
68
100,0
4
Nôn mửa
68
66
97,06
5
Ho
68
54
79,41
6
Dử mũi
68
54
79,41
7
Ỉa chảy

đối giống nhau. Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra được triệu chứng lâm sàng của
bệnh Care trên 68 chó nghiên cứu là đặc trưng và điển hình cho chó mắc bệnh
Care ở độ tuổi 3-6 tháng tuổi. Thông tin về triệu chứng lâm sàng thu được trong
nghiên cứu này sẽ giúp các bác sỹ thú y làm lâm sàng có thể chẩn đoán được chó
mắc bệnh Care dựa vào các triệu chứng điển hình của bệnh.
9


Một số hình ảnh minh họa triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care

Hình 4.1. Chó mắc bệnh Care có
các nốt sài ở vùng da mỏng.

Hình 4.2. Chó mắc bệnh Care có
gan bàn chân sƣng, cứng

4.1.3. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc
bệnh Care
Sau khi quan sát triệu chứng lâm sàng trên 68 chó mắc bệnh Care, tiến
hành xác định một số chỉ tiêu lâm sàng trên các chó bệnh và so sánh với chó
khỏe mạnh. Kết quả theo dõi ở giống chó Phú Quốc và Rottweiler được trình
bày ở bảng 4.3 và 4.4 đã cho thấy có sự thay đổi về các chỉ tiêu lâm sàng so với
chó khỏe mạnh đối chứng với sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Trong đó:
Thân nhiệt: chó mắc bệnh có biểu hiện sốt cao với thân nhiệt dao động từ
40,23 (giống chó lai Becgie) tới 40,590C (giống chó H’Mông Cộc).
Tần số hô hấp: chó bệnh có biểu hiện thở nhanh và nông hơn chó khỏe
mạnh với tần số hô hấp dao động từ 71,83 (lần/phút) (giống chó Rottweiler) tới
78,94 (lần/phút) (giống chó Phú Quốc).
Tần số tim: ở các chó bệnh thì tần số tim mạch tăng hơn so với chó khỏe
với tần số tim dao động từ 118,88 (lần/phút) (giống chó Fox) tới 130,75

0
38,78 ± 0,05
40,33 ± 0,05*
Thân nhiệt ( C)
39,33 ± 0,32
71,83 ± 0,44*
Tần số hô hấp (lần/ phút)
93,67 ± 0,36
130,75 ± 0,58*
Tần số tim mạch (lần/ phút)
Ghi chú: Mean là giá trị trung bình; SE là sai số chuẩn; *: khác nhau có ý nghĩa thống kê
với giá trị P < 0,05

4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó
mắc bệnh Care
Kết quả đếm số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, tỷ lệ các loại bạch
cầu bằng máy đo chỉ tiêu huyết học của giống chó Phú Quốc được trình bày ở
bảng từ 4.5. Khi xem xét ở các giống chó thì có sự thay đổi về các chỉ tiêu máu
như sau:
Số lượng hồng cầu: Ở những chó bệnh, số lượng hồng cầu trung bình là
từ 3,80 tới 4,26 (106/µl), đều giảm so với chó khoẻ. Trên lâm sàng, có thể
điều này có thể do con vật bị mất máu như xuất huyết, tiêu chảy ra máu kèm
theo sốt cao trong viêm phổi.
Hàm lượng huyết sắc tố: nhận thấy hàm lượng huyết sắc tố ở chó bệnh là
từ 110,81 tới 123,81 (g/l), giảm so với chó khỏe.
Tỷ khối hồng cầu: Tỷ khối hồng cầu của chó bệnh trung bình là từ
32,59% tới 34,18% giảm so với chó khỏe. Chỉ tiêu này cũng giảm tương quan
thuận với sự giảm số lượng hồng cầu, điều này cho thấy ở đây hiện tượng giảm
số lượng hồng cầu là do mất máu là chủ yếu.
Thể tích trung bình hồng cầu: Thể tích trung bình hồng cầu ở nhóm chó

5,85 ± 0,04
3,80 ± 0,06*
Hàm lượng huyết sắc tố (g/l)
153,06 ± 1,42 121,89 ± 0,80*
Tỷ khối hồng cầu (%)
40,22 ± 0,06 33,97 ± 0,05*
Thể tích trung bình hồng cầu (fl)
62,32 ± 0,05 46,48 ± 0,13*
Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg)
23,00 ± 0,10 18,12 ± 0,05*
Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (g/l) 334,70 ± 0,78 137,74 ± 0,73*
Số lượng bạch cầu (103/ml)
9,52 ± 0,05
4,78 ± 0,04*
Bạch cầu ái toan (%)
6,32 ± 0,03
5,75 ± 0,04*
Bạch cầu ái kiềm (%)
0,54 ± 0,05
0,45 ± 0,06
Bạch cầu đa nhân trung tính (%)
58,19 ± 0,07 63,28 ± 0,05*
Bạch cầu đơn nhân (%)
4,89 ± 0,07
3,66 ± 0,03*
Lâm ba cầu (%)
30,06 ± 0,14 26,86 ± 0,10*
Ghi chú: Mean là giá trị trung bình; SE là sai số chuẩn; *: khác nhau có ý nghĩa thống kê
với giá trị P < 0,05


Hạch lympho sưng to, xuất
huyết
Gan sưng, xuất huyết
Thận sưng, xuất huyết
Lách nhồi huyết, sưng to
Tim nhão, xuất huyết
Não sung huyết
12

68
68
68
68
68

54
54
58
62
60

79,41
79,41
85,29
91,18
88,24

68

68

viêm phế quản phổi chiếm tỷ lệ lần lượt là 85,29%, 79,41% và 79,41%. Kết quả
nghiên cứu này là phù hợp với triệu chứng lâm sàng quan sát được trên các chó
với biểu hiện là ho nhiều và có nhiều dịch mũi chảy ra.
Bệnh tích ở đường tiêu hóa thể hiện sung huyết ở ruột viêm, xuất huyết
(91,18%); sung huyết ở ruột non (88,24%) (hình 4.4) và gan sưng và xuất huyết
(88,24%). Kết quả nghiên cứu phù hợp với bệnh tích sung huyết, xuất huyết ở
ruột chó khi được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care cường độc
(Nguyễn Thị Lan và cs., 2015).
Bệnh tích ở não biểu hiện là não sung huyết chiếm tỷ lệ 5,88% là thấp
nhất trong các bệnh tích quan sát được trên 68 chó mắc bệnh Care.
Khi xem xét bệnh tích đại thể ở 68 chó nghiên cứu ở các giống chó khác
nhau thì bệnh tích đều tập trung chủ yếu ở các cơ quan như hạch lympho, phổi
và ruột. Điều này cho thấy sự phân bố và tập trung của virus trong các cơ quan
khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Ngoài ra, một số tổn thương khác cũng được
quan sát thấy khi mổ khám như lách nhồi huyết, sưng to chiếm tỷ lệ 70,59%;
thận sưng, xuất huyết chiếm tỷ lệ 58,82%. Bệnh tích trên tim chiếm tỷ lệ thấp
nhất lần lượt là 16,18%.
Một số hình ảnh minh họa bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh Care

Hình 4.3. Xuất huyết phổi ở chó Hình 4.4. Ruột bị sung huyết ở chó
mắc bệnh Care
mắc bệnh Care
4.1.6. Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care
Kết quả quan sát những biến đổi bệnh lý vi thể trên kính hiển vi quang
học được chụp ảnh và tổng hợp thông tin ở bảng 4.7.
13


Bảng 4.7. Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care
Các tổn thương

ck
12
12 100,0 10 83,33
12
12 100,0 4 33,33
12
12 100,0 8 66,67
12
12 100,0 9
75,0
12
7 58,33 6
50,0
12
1
8,33
0
0,0

Số
blo
ck
25,0
4
0,0
8
16,67 10
66,67 12
33,33 5
0,0

3
0
2
8
4
0

Thoái hóa
tế bào

Tỷ lệ
(%)

Tỷ lệ
(%)

12

12

100,0

12

100,0

7

58,33


12

11

91,67

12

100,0

3

25,0

10

83,33

11

91,67

Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ có tổn thương sung huyết và thâm
nhiễm tế bào viêm chiếm tỷ lệ cao hơn so với các tổn thương khác. Đặc biệt các
cơ quan như ruột non, ruột già, phổi và hạch lympho là những cơ quan có tổn
thương vi thể chiếm tỷ lệ cao hơn so với các cơ quan khác trong các cơ quan
được nghiên cứu.
Ở phổi có tổn thương sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm chiếm chiếm
tỷ lệ 100%; xuất huyết chiếm tỷ lệ 83,33%; hoại tử tế bào và thoái hóa tế bào
chỉ chiếm tỷ lệ lần lượt là 25,0% và 33,33%. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi

Nguyễn Thị Lan và cs., (2015) khi chỉ ra được các bệnh tích xuất hiện trên các
cơ quan trên.
Một số hình ảnh minh họa biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care

Hình 4.5. Viêm phế quản phổi
(HE. 10X)

Hình 4.6. Lông nhung ruột đứt nát
(HE. 10X)

4.1.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự
phân bố virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh
Tiến hành lựa chọn mẫu phổi, hạch phổi, ruột, hạch ruột, lách từ 68 chó
mắc bệnh Care để làm hóa mô miễn dịch. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8.
Kết quả ở bảng 4.8 cho thấy mức độ dương tính có sự sai khác giữa các cơ
quan khi chẩn đoán bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch. Trong đó, mức độ
dương tính ở tiêu bản phổi, ruột, hạch phổi và hạch ruột là cao hơn so với lách.
Kết quả nghiên cứu về sự phân bố của virus bằng nhuộm hóa mô miễn dịch là
tương đối phù hợp với kết quả quan sát được trên bệnh tích vi thể và đại thể của
68 chó nghiên cứu. Như vậy, khi chẩn đoán bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn
dịch để chẩn đoán chó mắc Care nên chọn 3 loại mẫu bệnh phẩm gồm phổi,
ruột, hạch lympho.
15


STT
Phổi
Hạch phổi
Ruột
Hạch ruột

Chú thích:
(-)
: Âm tính
(+) : Dương tính mức độ I (Có các đám nâu vàng nhưng mức độ rải rác)
(++) : Dương tính mức độ II (Có các đám nâu vàng với mức độ trung bình)
(+++) : Dương tính mức độ III (Có các đám rải rác với mức độ dày đặc)

Một số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch

Hình 4.7. Hóa miễn dịch dƣơng
Hình 4.8. Hóa miễn dịch dƣơng
tính tại phổi (IHC. 40X)
tính tại hạch lympho (IHC. 10X)
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC
4.2.1. Thông tin của những chủng virus Care phân lập đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu
5 chủng virus Care được lựa chọn đại diện cho 5 địa phương nghiên cứu
có thông tin chi tiết được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Thông tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu
Kí hiệu chó
Năm
Cơ quan Địa phương
STT Chủng virus Care nghiên cứu
phân
phân lập
phân lập
lập
1 CDV-VNUA-768
ND03

lựa chọn từ các chó mắc bệnh Care được phân lập từ thực địa. Các mẫu bệnh
phẩm dùng để phân lập virus đã được chẩn đoán dương tính với virus Care
bằng phương pháp RT-PCR và nhuộm hóa mô miễn dịch.
4.2.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân
lập đƣợc
Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của 5 chủng
virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort trên môi trường tế bào VeroDST được trình bày ở bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng
virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort
CPE (%)

STT

Virus

1

CDV-VNUA-768

5

25

55

90

100

B


95

100

B

4

CDV-HUA-04H

5

25

50

90

100

B

5

CDV-HUA-05P

10

30

20*%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt nuôi cấy
B: Tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy
hpi: hour post inoculation (giờ sau gây nhiễm virus)

Phân tích kết quả ở bảng 4.10 cho thấy 5 chủng virus được lựa chọn
nghiên cứu gây bệnh tích tế bào sớm, điển hình và phá hủy tế bào hoàn toàn rất
giống với chủng virus vacxin với biểu hiện là thời gian xuất hiện bệnh tích sớm
sau 24 giờ gây nhiễm với biểu hiện gây bệnh tích kiểu syncytium - thể hợp bào
với các tế bào co cụm lại, màng tế bào bị tan rã, các nhân co cụm lại và thời
gian hủy hoại hoàn toàn tế bào diễn ra nhanh, sau 60-72 giờ gây nhiễm các
chủng virus này CPE đạt 95 - 100%, lúc này không còn cụm tế bào nào bám
vào đáy bình, các tế bào đều đã bị tan vỡ bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy, các tế
bào đều bị phá hủy.
4.2.3. Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập đƣợc
Bên cạnh việc khảo sát khả năng gây bệnh tích tế bào, cũng tiến hành
kiểm tra hiệu quá virus, kết quả được trình bày ở bảng 4.11.
17


Bảng 4.11. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu
Hiệu giá virus
STT
Chủng virus
(Log TCID50/25µl)
1
CDV-VNUA-768
3,16 x 104
2
CDV-HUA-02H
3,16 x 105

lập được. Cả chủng virus vacxin Onderstepoort và 5 chủng virus Care phân lập
được đều cho thấy chúng tấn công, xâm nhập, nhân lên trong tế bào mạnh hay
yếu tùy từng thời điểm nhất định. Kết quả nghiên cứu là hoàn toàn phù hợp với
các nghiên cứu trước đây của Lan et al. (2005a, 2005b, 2007).
4.2.5. Nghiên cứu về tính kháng nguyên của chủng virus Care phân lập
đƣợc
Sau khi nghiên cứu được một số đặc tính sinh học của những chủng virus
Care phân lập được, chúng tôi lựa chọn ra một số chủng có đặc tính sinh học
điển hình, tiến hành dùng làm giống sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt để
đánh giá tính kháng nguyên và khả năng gây đáp ứng miễn dịch, trên cơ sở đó
lựa chọn chủng để nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh.
4.2.5.1. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của chó thí nghiệm sau khi
tiêm phòng vacxin lặp lại
Sau khi tiêm vacxin vô hoạt thử nghiệm chế từ chủng CDV-VNUA-768,
các chó được lấy máu hàng tuần để kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus
Care bằng phương pháp ELISA với kết quả được trình bày ở hình 4.11.

Hình 4.11. Biến động dƣơng tính huyết thanh học ở chó đƣợc tiêm hỗn
dịch kháng nguyên virus CDV-VNUA-768 vô hoạt so với lô đối chứng
Ở lô chó tiêm vacxin Care vô hoạt thì hiệu giá kháng thể tăng dần sau khi
tiêm lần 1 và lần 2 từ 0 tới 35 ngày, sau đó giảm dần sau 42 ngày tới 49 ngày
theo dõi. Hiệu giá kháng thể với giá trị OD lớn hơn giá trị tới hạn (Cut off) sau
21 ngày tiêm, sau đó đạt cực đại trong giai đoạn 35 – 42 ngày tiêm (ODtb = 1,54
> 0,3). Ở các ngày 42 tới 49 ngày sau khi tiêm, hiệu giá kháng thể giảm dần và
vẫn đạt trên ngưỡng giá trị tới hạn (Cut off) ở 49 ngày (ODtb = 1,35> 0,3). Hiệu
giá kháng thể sau khi tiêm lặp lại lần 2 cao hơn so với sau khi tiêm lần 1 điều
này có thể được giải thích do có đáp ứng trí nhớ miễn dịch nên có hiệu giá
kháng thể và có tỷ lệ bảo hộ cao hơn nhiều.
4.2.5.2. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của chó thí nghiệm sau khi
công cường độc

525, 528, 531, 533, 538, 552, 555, 556, 590, 591, 594, 606, 609, 625, 630, 635,
639, 653, 660, 666, 678, 679, 687, 696, 700, 712, 717, 721, 723, 733, 735, 739,
741, 756, 765, 772, 792, 801, 819, 828, 830, 840, 846, 864, 868, 876, 877, 894,
903, 926, 937, 939, 940, 957, 958, 963, 970, 981, 985, 990, 991, 993, 996, 999,
1009, 1017, 1026, 1029, 1032, 1041, 1046, 1056, 1059, 1072, 1074, 1076,
1094, 1095, 1096, 1100, 1108, 1116, 1118, 1119, 1126, 1127, 1128, 1140,
1156, 1164, 1179, 1182, 1194, 1201, 1202, 1212, 1218, 1243, 1249, 1272,
1275, 1281, 1290, 1299, 1305, 1325, 1336, 1356, 1362, 1365, 1375, 1377,
1378, 1379, 1386, 1392, 1399, 1422, 1423, 1424, 1434, 1437, 1450, 1455,
1458, 1474, 1476, 1491, 1494, 1500, 1505, 1515, 1517, 1528, 1539, 1550,
1557, 1564, 1572, 1578, 1584, 1587, 1588, 1589, 1590, 1591, 1599, 1608,
1619, 1632, 1644, 1645, 1674, 1683, 1711, 1714, 1728, 1738, 1743, 1747,
1750, 1752, 1755, 1756, 1758, 1776, 1779, 1780, 1809, 1814, 1818, 1821.
Qua việc so sánh trình tự nucleotide ở đoạn gene P giữa 5 chủng virus CDV
và chủng virus vacxin, đã chỉ ra được 27 vị trí sai khác về nucleotide ở các vị trí
20


như: 48, 49, 52, 55, 88, 96, 105, 129, 174, 183, 186, 216, 225, 230, 237, 243, 246,
250, 253, 269, 288, 307, 308, 344, 350, 356, 392.
Như vậy, khi so sánh về thành phần nucleotide ở đoạn gene H và gene P
giữa 5 chủng virus có sự sai khác về nucleotide không quá 12,66% và 6,72%
tổng số nucleotide của đoạn gene H và gene P. Điều này sẽ dẫn đến các chủng
virus trong cùng một nhánh phát sinh sẽ có ít sự sai khác về trình tự nucleotide.
4.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên
cứu
Từ kết quả so sánh trình tự nucleotide, tiến hành so sánh trình tự amino
acid được mã hóa tương ứng từ gene H và gene P giữa các chủng virus nghiên
cứu với chủng virus vacxin. Kết quả chỉ ra các vị trí sai khác axit amin mã hóa
từ gene H giữa các chủng virus nghiên cứu và chủng virus vacxin 83 vị trí: 21,



Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác nucleotide ở
đoạn gene H (hình 4.12) và gene P (hình 4.13) của 5 chủng virus Care nghiên
cứu, nhận thấy 5 chủng virus nghiên cứu nằm trong 3 nhánh phát sinh khác
nhau (thuộc 3 genotype lần lượt là Asia1, Asia2 và Classic), khác với nhánh
phát sinh của các chủng tham chiếu trên thế giới thuộc các genotype khác như:
Europe, Europe Wildlife, America 2, Africa, Arctic like, Asia 3. Kết quả nghiên
cứu này sai khác với nghiên cứu của Lan et al. (2005c, 2006a, 2006b, 2009b)
khi chỉ ra các chủng virus phân lập tại Nhật Bản và châu Á đang lưu hành 2
genotype chính là Asia 1 và Asia 2. Đồng thời, kết quả nghiên cứu này có sự sai
khác với kết quả nghiên cứu của Guo et al. (2013) đã chỉ ra chủng virus Care
gây bệnh trên gấu trúc và chó hoang là thuộc genotype Asia 1. Bên cạnh đó,
nghiên cứu của Lan et al. (2009a) đã chỉ ra chủng virus phân lập đầu tiên tại
Việt Nam là thuộc genotype Classic cùng với chủng virus CDV-HUA-04H mới
được phân lập trong nghiên cứu này. Điều này cho thấy có sự lây truyền bệnh
giữa các quốc gia trên thế giới do nhiều nguyên nhân khác nhau. Kết quả của
nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn chủng virus để nhập
khẩu vacxin hoặc chế tạo vacxin từ các chủng virus đang gây bệnh Care trong
nước để phòng bệnh.
100

BJ080514 China 2009 Asia1

70
97

CDV SY China 2014 Asia1
CDV-HUA-01P
CDV-HUA-05P


54

Europe

BV4 Austria 2011 Europe
A92-6 Netherlands 1996 America2

55
100

41

black leopard Denmark 1997 America2

America 2

4sp South Africa 2010 Africa

100

Africa

7L South Africa 2010 Africa

OND USA 2002

58
99


CDV-HUA-02H
5VD Japan 2003 Asia2

82
81

HLJ1 China 2008 Asia3

63
Seoul Korea 2007 Asia2
100

98Marten Korea 2008 Asia2
HM-3 Japan 2002 Asia2

0.01

22

Asia 3

Asia 2


Hình 4.12. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của
những chủng virus Care nghiên cứu
CDV-HUA-01P
S124C Japan 2006 Asia1
65


CDV-HUA-02H
51

007Lm/B Japan 2014
009L Japan 2007 Asia2
OND USA 2002
74

ferret 1017 Japan 2010
65

99

Rockborn Russia 1999 Classic

Classic

CDV-HUA-04H
Snyder Hill USA 2004 Classic

0.005

Hình 4.13. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của
những chủng virus Care nghiên cứu
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên 68 chó (độ tuổi 3-6
tháng) thuộc 6 giống khác nhau, được thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam
gồm Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang và Nam Định:
- Triệu chứng lâm sàng: sốt (100,0%), biếng ăn, ủ rũ (100,0%), có dử mắt