BỘ GIÁO DỤC – ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ
CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU TÔ MỘC
(Caesalpinia sappan L.)
Chuyên ngành: Vi sinh – SHPT
GVHD: ThS. Dương Nhật Linh
SVTH: Nguyễn Thời Thịnh
MSSV: 1153010789
Khóa: 2011 – 2015
Bình Dương, tháng 05 năm 2015


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

LỜI CẢM ƠN
Sau những ngày khóa luận tốt nghiệp vừa qua, em đã nhận được rất nhiều kiến
thức, kinh nghiệm trong thực hành nhờ vào sự giúp đỡ và chỉ dạy rất nhiệt tình của các
cô, các chị để em có thể hoàn thành tốt phần thực tập của mình. Nay em xin được gửi
lời tri ân tới:
Cô Dương Nhật Linh đã giành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp truyền đạt
cho em nhiều kiến thức bổ ích, luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................II
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... III
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... IV
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................... IV
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 5
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.)................................. 6
1.1.1. Vị trí phân loại cây tô mộc ............................................................................. 6
1.1.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 6
1.1.3. Phân bố, trồng trọt và thu hái ......................................................................... 7
1.1.4. Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm nhân gian ............................................... 7
1.1.5. Dược tính........................................................................................................ 8
1.1.6. Nghiên cứu về hóa học ................................................................................... 9
1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH....................................................................... 12
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI ...................................... 12
1.3.1. Escherichia coli ............................................................................................ 12
1.3.2. Salmonella typhi ........................................................................................... 13
1.3.3. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................ 14
1.3.4. Staphylococcus aureus ................................................................................. 15
1.4. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU ........................ 16
1.4.1. Các loại cao dược liệu .................................................................................. 16
1.4.2. Kỹ thuật chiết Soxhlet .................................................................................. 16
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI ............................................ 19
1.5.1. Thế giới ........................................................................................................ 19
SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN NỘI
SINH TỪ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) .................................................. 50
3.3.1. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây tô
mộc ......................................................................................................................... 50
3.3.2. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ
cây tô mộc .............................................................................................................. 53
3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI
SINH TỪ CÂY TÔ MỘC(CAESALPINIA SAPPAN L.) ................................................... 56
3.4.1. Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây tô mộc
................................................................................................................................ 56
3.4.2. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ
cây tô mộc .............................................................................................................. 57
3.5. ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CAO
NHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY TÔ MỘC ................................................................... 60

3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG CAO
CHIẾT THU ĐƯỢC TỪ CÂY TÔ MỘC .............................................................................. 61

3.7. KẾT QUẢ THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT...................................... 63
3.8. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY TÔ MỘC
.................................................................................................................................... 64
3.9. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT ...... 66
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 69
4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 70

Microsporum gypseum

MHA

Muller Hinton agar

MRSA

Methicillin – resistant Staphylococcus aureus là vi khuẩn
gram dương mọc thành cụm như chùm nho, sự tăng trưởng
của MRSA không bị ức chế bởi methicillin, oxacillin và
nhiều kháng sinh khác.

MIC

Minimum Inhibitory Concetration – Nồng độ ức chế tối
thiểu

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

NXB

Nhà xuấ t bản.



ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet ....................................... 17
Bảng 2.1. Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh của chất thử (MIC) .................................... 36
Bảng 3.1. Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn nội sinh từ cây tô mộc ........ 46
Bảng 3.2. Kết quả định tính khả năng kháng vi khuẩn bệnh của vi khuẩn nội sinh ...... 51
Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn
nội sinh (mm) ................................................................................................................. 53
Bảng 3.4. Kết quả định tính khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn nội sinh ............. 56
Bảng 3.5. Kết quả định lượng khả năng kháng nấm bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội sinh
(mm) ............................................................................................................................... 58
Bảng 3.6. Kết quả định danh sinh hóa chủng nội sinh ................................................... 61
Bảng 3.7. Khối lượng cao chiết thu được bằng các dung môi khác nhau...................... 62
Bảng 3.8. Kết quả số lượng nấm và vi khuẩn sống còn lại trong cao chiết từ cây tô
mộc. ................................................................................................................................ 63
Bảng 3.9. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết từ cây tô mộc......................... 64
Bảng 3.10. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ vỏ thân cây tô mộc
kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh (µg/ mL) ............................................................ 67

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

ii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH



DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình thí nghiệm ..................................................................................... 24
Sơ đồ 2.2. Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu ............................................ 32

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây tô
mộc ................................................................................................................................. 54
Biểu đồ 3.2. So sánh khả năng kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây
tô mộc ............................................................................................................................. 58
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết thu được từ thân
cây tô mộc ...................................................................................................................... 62
Biểu đồ 3.4. Kết quả kháng khuẩn của các loại cao chiết từ cây tô mộc ....................... 65

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

iv


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

1



cứu đó là có khả năng bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, sâu bệnh, mầm bệnh và
thậm chí cả động vật ăn thực vật (Webber, 1981). Hầu như tất cả các loài thực vật
SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

(khoảng 400.000) chứa ít nhất một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Tan và Zou, 2001).
Vì vậy, hướng đi mới trong điều chế thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nội
sinh thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn và nấm
bệnh ngày càng được quan tâm. Bên ca ̣nh đó còn có các nghiên cứu về vi sinh vật nội
sinh có khả năng sinh ra các chất ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn tiềm
năng quan trọng của chất kháng khuẩn (Ryan và cs., 2008). Các nghiên cứu của Sturz
và Matheson (1996), Krishnamurthy và Gnanamanickam (1997) đã chỉ ra rằng vi
khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát được mầm bệnh trên thực vật. Nghiên cứu của
Azevedo và cộng sự (2000) vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát được mầm bệnh ở
côn trùng. Bên cạnh đó nghiên cứu của Hallmann và cộng sự (1997) cũng đã chỉ ra
rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát được mầm bệnh cả ở tuyến trùng. Gần
đây vào năm 2013, tác giả Idris đã tiến hành nghiên cứu hoa ̣t tin
́ h kháng khuẩ n từ nấ m
nô ̣i sinh phân lâ ̣p từ cây thuố c Kigelia africana có khả năng kháng la ̣i Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Do đó, vi sinh vật nội sinh thực vật có một
tiềm năng rất lớn để sản xuấ t các hợp chất kháng nấm, kháng khuẩn có hoạt tính cao
ứng du ̣ng để làm chế phẩm sinh học dùng cho phòng trị các bê ̣nh do nấ m và vi khuẩ n
gây ra.
Vì vậy, nhằm phát huy và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, kết hợp

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÔ MỘC (Caesalpinia sappan L.)
Tên khoa học: Caesalpinia sappan L., thuộc họ Đậu (Fabaceae).
Tên khác: tô mộc, gỗ vang, tô phượng, vang nhuộm, mạy vang.
Tên nước ngoài: Su fang (Trung Quốc), Kayu sekang (Indonesia), Faang (Lào),
Sepang (Malaysia), Fang som (Thái Lan) (Kirtikar và Basu, 1989).

1.1.1. Vị trí phân loại cây tô mộc
Giới:

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp:



ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Lá: lá kép lông chim, gồm 12 đôi hay hơn 12 đôi. Lá chét nhỏ hình thang có gân
chính chéo, hơi hẹp ở phía dưới, tròn ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông mịn, lá
kèm biến đổi thành gai hình nón.
Hoa: hoa có 5 cánh, màu vàng, nhụy hơi lồi ra, bầu hoa phủ lông xám. Hoa mọc
thành chùm, cuống hoa có lông màu gỉ sắt.
Quả: quả là một giáp dẹt hình trứng, vỏ cứng, có sừng nhọn ở đầu, dài 7 – 10 cm,
rộng 3,4 – 4 cm, bên trong có 3 – 4 hạt dẹt màu nâu (Warriers và cs., 1993).

1.1.3. Phân bố, trồng trọt và thu hái
Cây tô mộc là loài của phân vùng Ấn Độ – Malaysia, thường mọc hoang trên các
nương rẫy, rừng thưa ở nhiều nơi, phổ biến ở Trung Mỹ, quần đảo Tây Ấn Độ,
Malaysia, Thái Lan. Ở Việt Nam, cây mọc nhiều ở vùng núi Tây Bắc.
Cây tô mộc còn được trồng nhiều để làm thuốc, có nơi trồng để làm hàng rào.
Cây dễ trồng bằng hạt vào mùa xuân.
Mùa hoa quả: hoa tháng 4 – 6, quả tháng 7 – 9 (Warriers và cs., 1993).

1.1.4. Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm nhân gian
Ở Trung Quốc, tô mộc dùng trị nội thương tích trệ, sưng đau, ngoại thương xuất
huyết, phong thấp, bế kinh, sản hậu ứ huyết, đau bụng, lỵ, phá thương phong, ung
thủng.
Ở Thái Lan, tô mộc dùng làm thuốc bổ huyết, thuốc trị bệnh phổi, làm long đờm,
điều kinh.
Ở Việt Nam, nhân dân ta thường dùng tô mộc làm thuốc săn da cầm máu. Trong
trường hợp sinh con mất nhiều máu, bị choáng váng hoa mắt, chữa lỵ ra máu, chảy
máu trong ruột.
Trong “Nam Dược Thần Liệu”, Tuệ Tĩnh có ghi: tô mộc vị mặn, tính bình, không
độc, trừ huyết xấu, sinh huyết tốt, trị đau bụng.

mạnh chống lại sự sản sinh ra 𝛽 – hexosaminidase là dấu hiệu trong tế bào bạch cầu.
Trong số các hợp chất thử nghiệm, sappanchalcone cho thấy tác dụng chống dị ứng
mạnh nhất (Yodsaoue và cs., 2009).
Hạ đường huyết/ Brazilin: Brazilin (7,11b – dihydrobenz [b] indeno – [1,2 – d]
Pyran – 3, 6a, 9, 10 (6H) – tetrol), đã được tìm thấy ở cây tô mộc có đặc tính hạ đường
huyết và tăng cường sự trao đổi chất glucose ở chuột mắc bệnh tiểu đường (Zhao và
cs., 2006).
Ức chế sự phát triển ung thư buồng trứng: nghiên cứu cho thấy dịch chiết cây tô
mộc ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào ung thư của con người và tăng biểu hiện cơ

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

chế gây chết tế bào của Caspase – 3, Caspase – 9 và làm giảm biểu hiện của sự ung thư
(Zhang, 2010).
Thành phần và cơ chế chống khối u: nghiên cứu của tác giả Shu S.H. đã cô lập
được 21 hợp chất. Neocaesalpin A, brazilein, brazilin, và sappanchalcone biểu hiện cơ
chế gây độc chống lại bảy tế bào khối u dòng Stilbene, (E) – 3, Y – xu – thoxy – 4, 4' –
dihydroxystilbene biểu hiện cơ chế chống lại độc tính D – GaIN sinh ra trong tế bào
WB – F344 (Shu, 2008).
Hoạt động ức chế neuraminidase/ chống virus cúm: nghiên cứu các thành phần cô
lập được 6 chất có khả năng ức chế neuraminidase như brazilein, brazilin,
protosappanin A, 3 – deoxysappanchalcone, sappanchalcone và rhamnetin. Trong số
này, 3 – deoxysappanchalcone và sappanchalcone cho thấy các biểu hiện cao nhất

Năm 1978, Yadava R.N., Saxena V.K., Nigam S.S. đã phân tích và cho thấy
trong dung dịch ly trích eter dầu của gỗ tô mộc chứa acid palmitic (27,6 %), acid
stearic (44,2 %), acid linoleic (25,6 %) và acid oleic (2,23 %).
Năm 1977, Nigam S.S., Saxena V.K., Yadava R.N. phân tích cho thấy trong gỗ tô
mộc có chứa một glycoside gồm phần aglicon là 𝛽 – amirin và phần đường là D –
glucose, các acid amin tự do là alanine, glicin, prolin, valin, leucin, treonin, norvalin,
các đường tự do: latose, galactose, socbose và D – glucose.
Năm 1985, Nagal M., Nagumo S. đã cô lập được protosappanin A (94,6 mg) sau
khi sắc ký cột silicagel (CHCl3 – CH3OH – H2O) cao methanol (39 g) của gỗ tô mộc
Năm 1987, Namikoshi M., Nakata H. và Saitoh N. đã cô lập được
3’ – deoxisappanol sephadex LH – 20 và silicagel với các dung ly: CHCl3 – CH3OH,
C6H6 – (CH3)3CO, hexan – (CH3)2CO.
Năm 1985, Yamahara J. đã cô lập được 3 hợp chất brazilin, protosappanin B và
protosappanin C từ cao methanol của gỗ tô mộc, sau quá trình sắc ký cột gel
(CHCl3 – CH3OH), poliamid (CH3OH) và cuối cùng với diaion (CH3OH – H2O).
Năm 1986, Saitoh T., Sakashita S. đã cô lập được hợp chất 3 – deoxisappanon B
và sappanol B sau khi sắc ký cột silicagel (CHCl3-CH3OH) và sắc ký cột saphadex
LH –20 (CH3OH) của cây tô mộc.

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây tô mộc


cũng sẽ giảm và có thể sản xuất với số lượng lớn đủ cho tất cả bệnh nhân (Selim và cs.,
2012).

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI
1.3.1. Escherichia coli
Phân loại như sau:
Phân ngành:

Proteobacteria

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Lớp:

Gamma Proteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Phân ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Gamma Proteobacteria

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Salmonella

Loài:


Chi:

Pseudomona

Loài:

Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994).

P. aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn,
hai đầu tròn, dài 1 – 5 µm, rộng 0,5 – 1 µm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di
động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm. Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 –
44oC), nhưng tối ưu ở 35oC. Trong môi trường đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một
loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác thì xù xì (Nguyễn Thanh Bảo,
2008; Lê Văn Phủng, 2012).

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa:
Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như: khi cơ thể bị suy
giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng
kháng sinh tùy tiện… Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da
chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,... Ngoài ra

Staphylococcus aureus (Buchanan và Gibbons, 1994)

S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, có thể
đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm
nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và
màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc
có vòng sáng rộng 2 – 5 mm.
S. aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người. Thường xảy
ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm
nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và

SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ThS. DƯƠNG NHẬT LINH

những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim. (Nguyễn
Thanh Bảo, 2008).

1.4. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU
Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế
bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ cao dược
liệu thực vật hay động vật với dung môi thực vật. Các dược liệu khi chiết xuất được xử
lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp).

1.4.1. Các loại cao dược liệu