ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ
THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ
THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan

Hà Nội - Năm 2017

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chƣơng 1- TổNG QUAN .................................................................................. 2
1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA ..................................................................... 2
1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam............................ 2
1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin ......................... 3
1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia ................... 4
1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia ..................................... 7
1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh .................................................. 10
1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY
MUTATION SYSTEM - PCR) ................................................................... 13
1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR............................................. 13
1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR ........................................ 14
1.2.3 Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật ARMS-PCR ........................ 16
1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia ........... 16
1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) .............. 17
1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic .............................. 17
1.3.2 Đầu dò trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc............................................. 18
1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc ................................. 20
1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia ....... 21
Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................... 23
2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................... 23
2.1.1 Nguyên liệu ..................................................................................... 23
2.1.2 Hóa chất........................................................................................... 23
2.1.3 Trình tự các đầu dò oligo sử dụng trong nghiên cứu ...................... 25
2.1.4 Trình tự các mồi .............................................................................. 26
2.1.5 Thiết bị ............................................................................................ 27
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 28


2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................. 28

5.5 Giải trình tự đoạn gen β-globin không có đột biến ............................ 66
6. LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) ...................................... 67
6.1 Đánh dấu trình tự đích cho quá trình lai điểm ngƣợc ........................ 67
6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc ........................................................ 68
6.3 Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm .................................................... 73
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 76
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 77

KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

(-)

Âm tính

(+)

Dƣơng tính

3‟UTR

3‟ Untranslated Region (Vùng 3‟ không dịch mã)

5‟UTR

5‟ Untranslated Region (Vùng 5‟ không dịch mã)

ADN

Acid deoxyribonucleic


dUTP

Deoxyuridine triphosphate

EDC

1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide
hydrochloride

H2O

Nƣớc

Hb

Hemoglobin huyết sắc tố

HbA

Adult hemoglobin

HbA2

Adult hemoglobin 2

HbE

Hemoglobin E


NBT

nitro-blue-tetrazalium

SA-AP

Streptavidine alkaline phosphatase

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SSC

Saline Sodium Citrate

TBE

Đệm Tris - Borate - EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)

WHO

World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới)

α


Hình 1.3.

Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia

11

Hình 1.4.

Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm

13

Hình 1.5.

Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer
arm

17

Hình 1.6.

Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc

18

Hình 2.1.

Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu

24


39

Hình 3.5.

Kết quả sàng lọc đột biến Cd41/42 bằng kỹ thuật ARMSPCR

40

Hình 3.6.

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen βglobin bằng cặp mồi 95 NF/Control R

52

Hình 3.7.

Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi vector
M13F/R

52

Hình 3.8.

Kết quả tách plasmid

53

Hình 3.9.



58

Hình 3.14.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T99
với ngân hàng dữ liệu NCBI

59

Hình 3.15.

Minh họa kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin

60

Hình 3.16.

Kết quả tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc

62

Hình 3.17.

Chuẩn hóa nồng độ đầu dò CD26 chấm lên màng

63


Hình 3.18.

7

Bảng 1.2.

Đặc điểm các mồi bình thƣờng và mồi đột biến của phản
ứng ARMS-PCR

14

Bảng 2.1.

Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm
ngƣợc

22

Bảng 2.2.

Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm
ngƣợc

23

Bảng 2.3.

Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

24

Bảng 2.4.

Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu
để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 41/42

30

Bảng 2.9.

Thành phần gel polyacrylamide 8%

30

Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn
gen đích cần tách dòng

32

Bảng 2.11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi
M13F/R

33

Bảng 3.1.

Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu máu thalassemia T1T10

36

Bảng 3.2.

Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42, Cd


Bảng 3.7.

Trung bình HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26

47

Bảng 3.8.

So sánh kết quả chẩn đoán sinh hóa với kết quả phân tích
PCR đa mồi

47

Bảng 3.9.

Tỉ lệ các loại đột biến β-thalassemia ở nhóm ngƣời kiểm
tra sức khỏe

49

Bảng 3.10. Tỉ lệ mang gen bệnh β-thalassemia ở một số nghiên cứu
tại Việt Nam

50

Bảng 3.11. Nồng độ các đầu dò chấm lên màng

64



Chƣơng 1- TổNG QUAN

1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA
1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam
Beta thalassemia (β-thalassemia) là nhóm các bệnh thiếu máu di truyền,
xảy ra do đột biến gen beta globin (β-globin) quy định việc tổng hợp chuỗi βglobin của hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc
vận chuyển oxy trong cơ thể. Theo tổ chức Y tế thế giới WHO, hiện nay, ƣớc
tính khoảng 1,5% dân số thế giới mang gen bệnh β-thalassemia. Hằng năm,
khoảng 50000 đến 100000 trẻ bị chết vì mắc bệnh β-thalassemia thể nặng ở
những quốc gia có thu nhập thấp và trung bình [73]. Bệnh phổ biến ở các khu
vực Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Ấn Độ, Bắc Phi, Trung Đông và Trung Á
[69]. Ngày nay, do quá trình di cƣ và hôn nhân giữa các dân tộc khác nhau,
bệnh trở nên phổ biến ở nhiều quốc gia châu Âu, châu Mỹ, châu Úc. Khu vực
Đông Nam Á chiếm khoảng 50% số ngƣời mắc bệnh trên thế giới, xấp xỉ 40
triệu ngƣời và khoảng một nửa số đó bị ảnh hƣởng sau sinh. Tần suất mang
gen bệnh ở khu vực này từ 0,5% đến 10% [69]. Các nƣớc phát triển châu Âu
và châu Mỹ chỉ chiếm khoảng 10% đến 30% số ngƣời mắc bệnh trên thế giới
[69]. Trung Đông và Tây Á, tần số mắc bệnh từ 2% đến 5% ở hầu hết các
nƣớc. Tại Bắc Phi, tần số mắc bệnh từ 2 đến 9%, trong khi Mỹ có tần số mắc
bệnh thấp, chủ yếu ở dân nhập cƣ [14].

2


Việt Nam là một trong những nƣớc có tỉ lệ mắc bệnh cao trên bản đồ βthalassemia thế giới. Ƣớc tính hiện nay có khoảng 20000 ngƣời bị thalassemia
thể nặng, mỗi năm có thêm khoảng 2000 trẻ em sinh ra bị bệnh, có khoảng 10
triệu ngƣời mang gen bệnh thalassemia [76]. Đặc biệt, tỷ lệ gặp cao ở một số
dân tộc ít ngƣời khi vấn đề hôn nhân cận huyết vẫn còn tồn tại nhƣ: Stiêng
(63,9%), Êđê (32,2%), Khơme (28,2%), Mƣờng (21,74%) [76].

Vùng 3‟ không dịch mã (3‟-UTR) nằm giữa codon cuối cùng TAA và
đuôi poly A, dài 132 bp, chứa trình tự bảo thủ AATAAA. Trình tự bảo thủ
này là tín hiệu gắn đuôi poly A vào sợi mARN [18].
1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia
Có khoảng 200 đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia đã
đƣợc tìm thấy, chủ yếu là các đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [70]. Các
đột biến này có thể xảy ra tại các trình tự exon hoặc intron, promoter, vùng 3‟
và 5‟ không dịch mã (Hình 1.2).
Tùy theo đột biến làm giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi β-globin
mà có thể dẫn tới mức độ nặng của bệnh β-thalassemia. Trƣờng hợp hoàn
4


toàn không còn sự tổng hợp chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia.
Trƣờng hợp giảm tổng hợp một phần chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình β+thalassemia. Trong khi đó, giảm tổng hợp chuỗi β-globin rất nhẹ dẫn tới kiểu
hình β++-thalassemia [11].
Đột biến điểm ảnh hƣởng tới sự biểu hiện của β-globin đƣợc chia thành
ba nhóm chính:
 Đột biến ảnh hƣởng đến quá trình phiên mã
 Đột biến vùng promoter: Các đột biến trên vùng promoter xảy ra tại
các trình tự bảo thủ là vị trí bám của các nhân tố phiên mã có vai trò
trong việc điều hòa biểu hiện gen, làm giảm hiệu suất quá trình phiên
mã từ 20-30% so với bình thƣờng [70]. Ví dụ, đột biến tại các vị trí -28
(A→G) và -29 (A→G) phổ biến ở ngƣời Trung Quốc và da đen, đột
biến tại các vị trí -87 (C→G) và -101 (C→T) phổ biến ở khu vực Địa
Trung Hải [70].
 Đột biến vùng 5’ không dịch mã: Bao gồm các đột biến đơn và mất
đoạn nhỏ. Đột biến ở vùng 5‟ không dịch mã làm giảm hiệu suất dịch
mã. Ví dụ, đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm hiệu suất dịch mã
khoảng 33% so với bình thƣờng [70].

thay thế nucleotide và hai đột biến mất đoạn nhỏ ảnh hƣởng tới trình tự
bảo thủ AATAAA đã đƣợc công bố [70]. Các đột biến này thƣờng dẫn
tới kiểu hình nhẹ β+-thalassemia. Đột biến tại vùng 3‟ không dịch mã
(C→G vị trí +1480) gây β+-thalassaemia [70].
 Đột biến ảnh hƣởng đến quá trình dịch mã mARN
 Đột biến codon mở đầu: Có 9 đột biến liên quan tới codon ATG là tín
hiệu bắt đầu dịch mã dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia [70].
 Đột biến vô nghĩa: Một số đột biến thay thế dẫn tới kết thúc sớm chuỗi
β-globin. Nguyên nhân là do đột biến trực tiếp tạo codon kết thúc hoặc
thêm hay mất một vài nucleotide dẫn tới thay đổi khung đọc mở, tạo
6


codon kết thúc sớm. Ví dụ, đột biến tại Cd 17 (A→T) của exon 1, làm
thay đổi axit amin lysine chuyển thành thymine, đƣợc phiên mã thành
bộ ba kết thúc UAG ở mRNA là đột biến phổ biến ở Thái Lan và Việt
Nam [12,57].
 Đột biến khung: Thêm hoặc mất một hoặc vài nucleotide làm thay đổi
khung đọc mở tạo kiểu hình β+-thalassemia. Điển hình nhƣ đột biến
mất nucleotide A tại Cd 6 phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, đột biến
gây lệch khung đọc do mất 4 nucleotide TCTT tại Cd 41 và 42 phổ biến
ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam [15,57].

Hình 1.2. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia [45].
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 8 đột biến
thƣờng gặp, chiếm khoảng 95% các trƣờng hợp β-thalassemia bao gồm: Cd
17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT), -28 (A→G), Cd 71/72 (+A), IVS1.1 (G→T),
IVS1.5 (G→C), IVS2.654 (C→T) và Cd 26 (G→A) tạo biến thể HbE [57].
1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia
Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia đƣợc chia thành ba thể

β+/β++
β+/βo
βo/βo + yếu tố ảnh
hƣởng

Hb: 6-10 g/dL
MCV: 55-70 fL
MCH: 15-23 pg

HbA2 tăng
HbF tăng
100%

β++/β
β+/β
βo/β

Hb nam: 9-15 HbA2 >3.2%
g/dL
HbF: 0,5-6%
Hb nữ: 9-13
g/dL
MCV: 55-75 fL
MCH: 19-25 pg

βthalassemia
thể nhẹ

đến


Sự kết hợp của HbE với β-thalassemia làm cho biểu hiện lâm sàng trở
nên đa dạng, có thể thay đổi giống nhƣ thalassemia từ thể nặng đến thể nhẹ
[70]:
- β-thalassaemia/HbE thể nhẹ: không cần điều trị và hiếm khi biểu hiện
các triệu chứng lâm sàng, nồng độ hemoglobin từ 9-12 g/dl. Thể HbE kết hợp
với các đột biến -28 (A→G) hoặc Cd 19 (A→G) có thể dẫn tới kiểu hình thể
nhẹ [70].
- β-thalassaemia/HbE thể trung gian: triệu chứng giống với βthalassemia thể trung gian, nồng độ hemoglobin từ 6-7 g/dl. Thể HbE kết hợp
với đột biến IVS1.5 (G→C) có thể tạo kiểu hình thể trung gian [70].
- β-thalassaemia/HbE thể nặng: triệu chứng giống với β-thalassemia thể
nặng, nồng độ hemoglobin thấp, chỉ từ 4-5 g/dl. Thể HbE kết hợp với các đột
biến Cd 17 (A→T) hoặc Cd 41/42 (-TCTT) có thể dẫn tới kiểu hình thể nặng
[70].

9


Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: Sự kết hợp đột biến αthalassemia có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia thể nặng
thành thể trung gian. Trong hầu hết các trƣờng hợp bệnh đều có liên quan đến
kết hợp 3 gen α-globin (ααα/). Thừa hai gen α-globin (ααα/ααα) hoặc
(αααα/αα) kết hợp với β-thalassemia thể nhẹ tạo thalassaemia thể trung gian
[8,24]. Tuy nhiên, khi thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình lâm sàng phụ
thuộc vào mức độ nghiêm trọng của đột biến β-thalassemia [10,62].
1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh
1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng
Trẻ bị thalassemia thể nặng sau hai tuổi bị nghi ngờ mắc bệnh βthalassemia với các biểu hiện thiếu máu nặng, vàng da, lách to. Trẻ bị
thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn. Với trẻ mang gen
bệnh thƣờng không có triệu chứng, đôi khi chỉ là thiếu máu nhẹ [22].
1.1.5.2 Chẩn đoán huyết học
Chỉ số hồng cầu: Bệnh nhân thalassemia thể nặng có nồng độ

98% HbA1, 2% HbA2 và rất ít HbF [11]. Các trƣờng hợp bệnh β-thalassemia,
chuỗi β-globin không đƣợc tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ,
α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2. Đối với các trƣờng hợp
có đột biến Cd 26 gây thể HbE sẽ có hiện diện HbE≥25% trên điện di Hb
[11]. Do đó, HbA1, HbF, HbA2, HbE đƣợc coi là các tiêu chuẩn điện di
hemoglobin đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia [11].
HbA2≥4,0% là chỉ số thƣờng đƣợc dùng để chẩn đoán β-thalassemia. Trƣờng
hợp HbA2≥4,0% và chỉ số hồng cầu giảm, đƣợc chẩn đoán là mang gen bệnh
β-thalassemia. Khi HbA2>4,0%, nhƣng chỉ số hồng cầu bình thƣờng, ngƣời
bệnh có thể thiếu vitamin B12/folate, bệnh gan hoặc nhiễm HIV. Các trƣờng
hợp có HbA2 từ 3,3-3,9% cần khẳng định bằng phân tích ADN. Tuy nhiên,

11


mức độ HbA2 và/hoặc chỉ số hồng cầu có thể bình thƣờng ở ngƣời bệnh βthalassemia có gen β-globin bị đột biến vùng promoter hoặc đuôi poly A. Khi
đỉnh HbA2>10%, ngƣời bệnh có thể có các biến thể hemoglobin khác, ví dụ
HbE, HbS,... [25]. Sơ đồ sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh β-thalassemia
đƣợc trình bày ở Hình 1.3.

Hình 1.3. Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia [14].
1.1.5.3 Phân tích di truyền phân tử
Hầu hết các kỹ thuật phát hiện các đột biến trên gen β-globin hiện nay
thƣờng dựa trên PCR, đƣợc chia thành hai nhóm chính: lai oligonucleotide
đặc hiệu allen và mồi đặc hiệu allen [23].

12


Lai oligonucleotide đặc hiệu allen (Allele - specific oligonucleotide