B ộ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ T H ự C PHẤM

HUỲNH THỊ NGÂN TÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
CỦA CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

ĐỒ ÁN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHÉ BIÉN THỦY SẢN

Nha T rang - 2012


B ộ GIÁO VÀ Đ ÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ T H ự C PHẤM

HUỲNH THỊ NGÂN TÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NẢNG KHÁNG KHUẨN
CỦA CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

ĐÒ ÁN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIÉN THỦY SẢN

Giảng viên hướng dẫn:
Ks VŨ LỆ QUYÊN
Th.s NGUYÊN THỊ THANH HẢI

thảng

năm 2012

CẢN B ộ HƯỞNG DẴN


Lội cảm ơn
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Vũ Lệ Quyên, cô Nguyễn Thị Thanh Hải,
đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài này.
Qua đây cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến:
- Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang.
- Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm.
- Các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm.
- Các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm, các anh chị trong phòng thí nghiệm cùng
các bạn sinh viên.
Đã quan tâm, đóng góp ý kiến, tận tình giúp đỡ em hoàn thành được đồ án này.


Mục lục
Trang
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT............................................................................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ.....................................................................iii
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................iv
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 1
1.1.Tổng quan về chitin-chitosan, chitosan phân từ lượng thấp................................ 1
1.1.1. Chitin-chitosan..................................................................................................1
1.1.2. Chitosan phân tử lượng thấp............................................................................. 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất chitosan và chitosan oligosaccharide............7

2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm............................................................. 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN

cứu VÀ THẢO LUẬN....................................30

3.1 Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn gram (-)......................................................... 30
3.1.1 E.Coli................................................................................................................30
3.1.2 Salmonella........................................................................................................35
3.2 Kết quả nghiên cứu trên vi khuẩn gram (+)........................................................ 39
3.2.1 S.aureus.............................................................................................................39
3.2.2 Listeria............................................................................................................. 43
3.3 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Gram(-) và Gram(+) của chitosan................ 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 50
I.

Kết luận................................................................................................................. 50

II.

Đề xuất ý kiến......................................................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................51
PHỤ LỤC

ii


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chitosan olygosaccharide

Giải thích

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng

STT

Trang

1

Bảng 1: Hàm lượng chitin của một số loại phế liệu thủy sản.

8

2

Bảng 2: Kết quả kháng E.Colỉ của chitosan và chitosan phân tử lượng

58

thấp (% E.Colỉ bị chết).
3


1

Hình 1: Chitosan dạng vảy.

9

2

Hình 2: Công thức cấu tạo của chitin và chitosan.

11

3

Hình 3: Chitosan phân tử lượng thấp.

12

4

Hình 4: Hình ảnh kết quả kháng E.Coli.

36

5

Hình 5: Biéu đổ kết quả kháng E.Colỉ của c , C1 ở 60 phút (a), 90 phút

37


Hình 10: Hình ảnh kết quả kháng S.aureus.

45

11

Hình 11: Biếu đồ kết quả kháng S.aureus của c , C1 ở 60 phút (a), 90

47

phút (b), 120 phút (c).
12

Hình 12: Biếu đồ kết quả kháng S.aureus của C (a), C1 (b) theo nồng độ

49

và thời gian.
13

Hình 13: Hình ảnh kết quả kháng Listeria.

50

14

Hình 14: Biếu đồ kết quả kháng Lỉsterỉa của C, C1 ở 60 phút (a), 90 phút

51


ngày càng trở nên cấp bách. Đây là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất chitin chitosan và chitosan phân tử lượng thấp. Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất
chitin-chitosan và chitosan phân tử lượng thấp là rất quan trọng để nâng cao giá trị sử
dụng phế liệu này và làm sạch môi trường.
Chitosan là một polysaccharide có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, ghẹ. Đặc tính của
chitosan là không tan trong nước, có thể hòa tan trong acide nhẹ và có khả năng kháng
khuẩn cao. Hiện chitosan đang được các nhà công nghệ chế biến nghiên cứu sử dụng
trong nhiều lĩnh vực công nghệ. Trong công nghệ sau thu hoạch, chitosan được sử dụng
làm màng bao bên ngoài của các các loại trái cây như xoài, chôm chôm,... để hạn chế sự
thoát hoi nước và kháng khuẩn. Vì thế khi nhúng chitosan bên ngoài trái cây sẽ tạo cho
trái cây có cảm quan đẹp bóng, giúp kéo dài thời gian bảo quản trái cây. Trong lĩnh vực
chế biến thủy sản, chitosan được dùng để xử lý thịt, cá, tôm nhằm hạn chế sự hao hụt
khối lượng trong quá trình cấp đông cũng như hạn chế sự phát triển của

vsv gây hư

hỏng sản phẩm, không những thế thủy sản sẽ có chất lượng cảm quan tốt hơn...
Từ chitosan, Thái Viết Chiêu đã nghiên cứu thủy phân chitosan thành chitosan
phân tử lượng thấp với mục đích nâng cao khả năng kháng khuẩn và tăng khả năng hòa
tan của chitosan, từ đó mở rộng phạm vi ứng dụng của chitosan.
vĩ


Hiện nay các hóa chất bảo quản thực phẩm như hàn the, Urea...bị cấm sử dụng
trong lĩnh vực xuất khẩu thủy sản, thì đây là một con đường mới để chúng ta nghiên cứu
và áp dụng trong thực tế sản xuất. Tuy vậy, hiện nay các công trình nghiên cứu ứng dụng
chitosan và chitosan phân tử lượng thấp trong các lĩnh vực của đời sống còn rất ít. Chính
vì vậy, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chỉtosan phân tử
lượng thấp” với mục tiêu đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng
thấp để ức chế một số vsv gây bệnh .
Trong thời gian thực hiện đề tài, mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng bên cạnh việc

sinh tổng hợp mỗi năm khoảng 2,3xl09tấn ( Jeuniaux et al.,1993 ).[3]
Chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết với protein dưới dạng phức hợp,
cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết. Chitin
là một polysaccharide được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu
nối 1,4- glucozide. Chitin có cấu trúc hóa học giống cellulose và có thể xem là một dẫn
xuất của cellulose với nhóm acetamido ở cacbon số 2. Chitin đóng vai trò là thành phần
tạo nên độ cứng chắc của vỏ giáp xác. Hàm lượng chitin biến đổi theo từng loại nguyên


liệu, trong đó phế liệu mực ( nang mực ống ) có hàm lượng chitin cao nhất, tiếp theo là
tôm sú và tôm thẻ.[3]

Nguồn

Phế liệu cua, ghẹ

Cua xanh

Ghẹ chấm

(Callinectes)

(Portunus

Phế liệu tôm sú

Phế liệu

(Penaeus monodon)


Hình 1: Chitosan dạng vảy

Công thức phân tử của chitosan [C6Hn0 4N]n
Phân tử lượng trung bình của chitosan = (161,07)n
Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá
trình deacetyl hóa chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan
được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Công thức cấu tạo của chitosan
gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhỏm amin ở cacbon thứ
2.[2],[3]

3


Sự khác nhau về công thức cấu tạo giữa chitin, chitosan được thể hiện ở hình sau:

Chitosan
Hình 2: Công thức cấu tạo của chitỉn và chitosan

• Một số tính chất của chỉtosan
- Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hay hơi
vàng.
- Chitosan không hòa tan trong nước, kiềm, cồn.
- Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như: acid formic, acide
acetic, acide propionic, acid citric, acide lactic...Khi hòa tan chitosan trong môi trường
acid loãng tạo thành keo dương, nhớt và trong suốt. Đây là một điểm rất đặc biệt của
chitosan vì đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương
sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion
kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm ... , nhờ đó mà keo chitosan không
bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb, Hg,...
- Chitosan kết hợp với aldehyde trong điiều kiện thích hợp, hình thành gel, đây là

đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh
vực nghiên cứu sản xuất chitosan là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ẩn Độ, Pháp. [5], [6], [7]
Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới sản xuất 20 tấn/năm (1973), đến nay là 700
tấn/năm. Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know thì năm 1991 thị trường có nhiều
triển vọng của chitin-chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật được coi là nước dẫn
đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin-chitosan. Người ta ước tính sản lượng
chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm; trong đó Nhật, Mỹ là nước sản xuất chính. [5], [6]
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin - chitosan và ứng dụng của chúng
trong sản xuất phục vụ đời sống là tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978 - 1980,
trường Đại học Thủy Sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả
Đỗ Minh Phụng đã mở đầu bước ngoặt quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên chưa
có ứng dụng nào trong thực tế sản xuất. [4], [6], [8]
Hiện nay nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường
Đại học Nha Trang, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu
polymer - Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Hóa thuộc Viện Khoa Học Việt Nam tại
Thành Phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản- Viện nghiên cứu
môi trường thủy sản 2,...Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học
thuộc trường Đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở
bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ
enzyme.
Đáng kể nhất là các công trình của Trần Thị Luyến và các cộng sự đã sử dụng
enzyme papain, chitinase và vi khuẩn lactic trong công nghệ sản xuất chitosan. Những
kết quả này đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu thủy sản, giảm thiểu
nguồn ô nhiễm môi trường ở nước ta và trước những yêu cầu khắt khe về chất lượng
chitin-chitosan trên thị trường hiện nay.
Như vậy, với tính ưu việt của chitosan như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,
chống mất nước trong quá trình bảo quản, dễ rửa trôi trước khi đưa thực phẩm vào chế
6



7


- Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ
tiêu sinh lý, sinh hóa của lúa mạ ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan
vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng ni tơ tổng số, đồng thời hàm lượng
các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên.
- Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ phương pháp bao hạt giống
bằng chitosan. Kết quả cho thấy, trong vùng đất mà thường bị nấm tấn công vào rễ, thu
hoạch mùa màng được nâng cao đến 20% nếu các hạt giống thu được bao bằng chitosan.
Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam đã phối hợp với Trung Tâm Công Nghệ
Sinh Học Thủy Sản cùng tham gia vào nghiên cứu tác dụng thực tiễn của chế phẩm
chitosan, đối với một số loại hạt dễ mất sức nảy mầm và góp phần vào thúc đẩy sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng ở ngoài đồng. Qua nghiên cứu người ta thấy rằng xử lý
chitosan nồng độ 2% có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì sức nảy mầm cao của
hạt giống cà chua và hạt giống đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 - 1 2 tháng trong điều
kiện môi trường bình thường.[4], [9]
• Trong công nghiệp thực phẩm
- Chitosan được sử dụng để bảo quản thực phẩm, trái cây do dịch keo chitosan
(keo dương) có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm men, vi sinh vật
Gram (-) trên các loại hoa quả.
- Chitosan được sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh,
làm đông thực phẩm.
- Chitosan được sử dụng như một polymercationit trong sản xuất agarose chất
lượng cao từ agar có chất lượng kém.
- Chitosan có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các chất khác nên nó được
ứng dụng vào việc khử màu đồ uống.
- Do chitosan có tính diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói
thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước.
- Màng mỏng chitosan dùng trong thực phẩm: Chitosan không hòa tan trong

phân hủy sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lóp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau,
giúp các vết sẹo, bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng và chống nhiễm trùng. Ở Việt Nam,
Đại học Dược Hà Nội cũng đã chế tạo thành công loại màng này và bước đầu ứng dụng
có hiệu quả.
9


- Trường Đại học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu từ
chitin, nhờ phát hiện ra một dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ
thường mà không làm phá hủy cấu trúc polymer.
- Dùng làm màng mỏng polymer sinh học: Hiện nay trên thế giới ngày càng sử
dụng hợp chất cao phân tử vào mục đích chữa bệnh. Đã có rất nhiều thuốc chữa vết
thương, vết bỏng nông diện hẹp, nhưng đối với vết thương, vết bỏng sâu, rộng thì việc
che phủ và điều trị vẫn còn khó khăn. Phòng Polymer Dược Phẩm - Viện Hóa Học
đã nghiên cứu màng polymer sinh học để chữa liền vết thương, vết bỏng và dùng trong
phẫu thuật phá da. Màng polymer được nghiên cứu trên fibrolasts và tế bào lòng mạch,
đó là 2 yếu tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình liền vết thương, đặc biệt ở giai đoạn
sớm.
Kết quả bước đàu cho thấy màng polymer sinh học thu được có những tính năng
cần thiết để điều trị vết thương. Màng trong suốt có độ mềm, dẻo và đàn hồi. Màng có tác
dụng tốt trên tế bào, không gây độc cho tế bào biểu mô, có tác dụng kháng nấm, kháng
khuẩn làm vết thương mau lành. Qua nghiên cứu người ta thấy rằng sử dụng màng
polymer sinh học đã hạn chế đáng kể số lần thay băng, tiết kiệm thuốc, nhanh khỏi bệnh
và giảm sự đau đớn của bệnh nhân.
- Dùng làm thấu kính tiếp xúc: Ở Mỹ, Revlon Bave Hing đã được cấp bằng sáng
chế của Đại học Wasington là sản xuất ra thị trường một thấu kính tiếp xúc không có tính
chất quang học từ dẫn xuất của Chitin. Các nhà nghiên cứu nghĩ ràng nó có thể giúp cho
việc làm sẹo hóa các giác mạc bị tổn thương.
- Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày - tá tràng: Khoa Dược - Trường
Đại học Y Dược Tp.HCM đã nghiên cứu từ chitin - chitosan điều chế ra các loại gel: Gel

tác dụng kích thích tế bào, có nhiệm vụ miễn dịch đối với các tế bào khối u và các tác
nhân gây bệnh. Sự bảo vệ có hiệu quả của các hợp chất này đã được quan sát thấy ở
chuột được tiêm Staphylococus aureus. Những nghiên cứu giờ đây hướng vào các
olygomere của glucosamine và N- axetyl glucosamine mà nó cũng có tính chất của
polymer tương ứng nhưng nó có ưu điểm là tan trong nước và rất dễ hấp thụ.
- Đặc tính làm giảm cholesterol: Năm 1980, Sugano và cộng sự đã chứng minh
đặc tính làm giảm cholestorol của Chitosan trên chuột bạch và nó không gây tác dụng
phụ. Khoa Dược - Trường Đại Học Y Dược TP HCM đã nghiên cửu sử dụng Chitosan
11


và olygomereChitin để sản xuất một số chế phẩm hạ cholesterol trong máu, có thể dùng
riêng biệt hoặc kết hợp một số chất khác dưới dạng chế phẩm như thuốc, thực phẩm,
nước giải khát... Mức cholesterol giảm tới 20 - 30 % sau khi dùng 20 ngày, không gây
độc hại cho cơ thể, mức độ ảnh hưởng chỉ tác động khi vượt quá 18g/ngày/lkg thể
trọng.[4], [9]
• Trong sinh học
Chitosan được sử dụng khá rộng rãi làm vật liệu cố định enzyme và tế bào thông
qua cầu nối glutaraldehyt hoặc được nhốt trong gel. Tuy nhiên vật liệu Chitosan còn biểu
hiện nhiều nhược điểm về tính chất cơ lý, độ bền hóa học và hoạt tính enzyme còn thấp.
Để khắc phục nhược điểm này nhiều công trình nghiên cứu đã cho phép sử dụng xạ
styrene, metyl, metacaylat, acrylonitrit lên chitosan, tạo ra những vật liệu compolyme có
độ bền cơ lý và hóa học cao.
Khoa Sinh Học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM và Phòng Công
Nghệ Bức Xạ - Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã nghiên cứu phép bức xạ
compolyme của HEMA (Hydroxyl Ethyl Methacrylat) với Chitosan để cố định enzyme
trypsin.
Phương pháp ghép compolymer được trình bày như sau: Dung dịch Chitosan
1.5% được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong dung dịch axit acetic 1%, monome HEMA
được khuếch tán đều trong dung dịch Chitosan, sau đó được chiếu xạ trong nguồn gama

xuất đồ bảo hộ lao động.
Xuất phát từ tính chất lý hóa của Chitosan, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo của trường
Đại học Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất vải colle bằng cách phối trộn dịch keo
Chitosan 6% với chất phụ gia tạo thành dịch hồ, sau đó đem dịch hồ này đi hồ vải, cán,
giặt sạch, làm khô được vải colle. Vải này được dùng trong may mặc, kết quả cho thấy
vải này có màu trắng, khi khô thì cứng, khi ướt thì mềm mại như vải, không gãy, tạo nếp
khi gấp, vải colle bền trong dung dịch xà phòng, nước javen, nước sôi, không bị thoái hóa
ở nhiệt độ cao.
Làm sợi Chitin: Vì Chitin thuộc loại polysaccharide, do đó có thể dùng nó để sản
xuất sợi Chitin theo phương pháp sản xuất sợi keo dính, đây là một loại sợi nhân tạo, nó
có thể dùng với sợi bông, sợi hóa học sản xuất từ nguyên liệu khác để tăng nguyên liệu
cho ngành dệt. Sợi Chitin được sản xuất bằng cách ngâm Chitosan trong dung dịch
13


Na2S04 bão hòa rồi đem kéo sợi. Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30:70 thu được
sợi Chitin - Cellulose. Khả năng bắt màu tăng khi tăng tỷ lệ sợi Chitin. [4], [9]
- Trong mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm cho da, do tính
chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên lớp biểu bì của da nhờ các nhóm -NH4+,
các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da. Nhờ vậy các nhà khoa học đã nghiên
cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng bằng cách ngăn các chất
độc, lọc tia cực tím với nhóm -NH4+. Kem dưỡng da được tổng họp như sau: Rót dung
dịch B gồm sáp ong 5%, sáp parafin 10%, stereat sodium 6%, dầu khoáng 50% và dung
dịch A gồm nước 15%, triethanolmin 15%, glycerin 6%, kalicacbonat 0.3% sau đó khuấy
đảo và cho thêm chitossan vào. Qua nghiên cứu cho thấy kem dưỡng da Chitosan có khả
năng kháng nguyên làm sạch da, kích thích sự phát triển của tế bào non, làm cho da dẻ
hồng hào.
Chitosan được sử dụng là thành phần của keo xịt tóc, do chitosan là polyamine
(điện dương ) có thể kết hợp với các protein của tóc và nhờ độ keo của nó khi khô sẽ làm
cho tóc cứng, giữ được nếp của tóc.