TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
TRƢỜNG ĐẠI
HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
------------------------KHOA SINH – KTNN
-------------------------

NGUYỄN NGUYỆT QUỲNH

NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN
HOÀNG THẢO Ý NGỌC (Dendrobium transparens
Wall. ex Lindl.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
THỰC VẬT

LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngƣời
hƣớng
Chuyên ngành: Sinh
lý học
thựcdẫn
vậtkhoa học
TS. LA VIỆT HỒNG


quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong
khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.
Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Quỳnh


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

α- Napthlacetic acid

KIN:

Kinetin

IBA:

Indol 3- butyric acid

IAA:

- Indole- acetic acid

BAP:

6- Benzyl amino purin


1.2. Đặc điểm sinh học của cây lan ............................................................... 6
1.2.1. Hạt lan............................................................................................... 7
1.2.2. Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan ............. 7
1.2.3. Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan ............................ 9
1.3. Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam ...... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới ........................ 9
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium ở Việt Nam ........................ 12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 14
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ........................................................... 14
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................. 14
2.3.1. Thiết bị ............................................................................................ 14


2.3.2. Dụng cụ ........................................................................................... 14
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy............................................................................. 14
2.5. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 15
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 15
2.6.1. Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm ............... 15
2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro: ............................................................... 16
2.6.3. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh: .................................................. 16
2.6.4. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: ............... 16
2.7. Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm ............................................... 16
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 18
3.1. Nhân nhanh protocorm và tạo chồi từ protocorm ................................ 18
3.1.1. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm ...... 18
3.1.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm ..... 19
3.2. Nhân nhanh chồi in vitro ...................................................................... 21
3.2.1. Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi.................................. 21
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi ................................. 22

MS +10% ND ................................................................................... 20
Hình 3.3. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS + 0,5 mg/l KIN ............................................................... 22
Hình 3.4. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS ........................................................................................ 23
Hình 3.5. Chồi in vitro của D. transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi
trƣờng MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA ................................... 25
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy............................................................................ 26
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D. transparens
sau 6 tuần nuôi cấy............................................................................ 28
Hình 3.8. D. transparens in vitro rèn luyện ngoài tự nhiên ............................. 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Họ Phong lan là một họ lớn nhất của thực vật có hoa với hơn 800 chi
và 25.000 loài. Hoa lan đƣợc đánh giá cao bởi vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ và sự
đa dạng về kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. Hiện nay, hoa lan chiếm 8% trong
ngành thƣơng mại hoa thế giới và có tiềm năng thay đổi tình hình kinh tế của
một quốc gia [26].
Chi Dendrobium thuộc họ Phong lan là một trong những chi thực vật
phổ biến nhất trên thế giới, chi này có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng
khắp ở Châu Á, Bắc Australia và New Zealand. Các loài thuộc chi này sinh
trƣởng nhanh, dễ dàng tái sinh thế hệ mới, hoa đẹp, ra hoa quanh năm [16].
Ngoài giá trị thƣơng mại, một số loài lan thuộc chi Dendrobium còn là thành
phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc và Ấn Độ [44]… Trong tự
nhiên, các loài lan sinh trƣởng chậm, tái sinh chủ yếu bằng hạt. Tuy nhiên,
khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt lan là cực kì thấp. Do đó, khả năng phục
hồi của các quần thể lan ở rừng tự nhiên là rất khó [1], [2].

Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D.
transparens Wall. ex Lindl.) nhằm tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình
sản xuất.
3. Phạm vi nghiên cứu
Tiến hành các nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.
4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu
invitro về lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall. ex Lindl.).
Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể đƣợc sử dụng nghiên cứu
trong nuôi cấy mô tế bào lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens Wall. ex
Lindl.). Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng
dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bảo

2


tồn các nguồn gen quý về loài hoa lan.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về chi Dendrobium
1.1.1. Vài nét về chi Dendrobium
Chi Dendrobium thuộc nhóm lan đa thân, là một chi lớn trong họ lan
với trên 1600 loài đƣợc chia thành 40 nhóm, phân bố trải dài từ Triều Tiên,
Nhật Bản qua Đông Dƣơng, Malaysia, Indonesia đến Australia, các đảo
Polynesi. Giống lan này đƣợc đặt tên và trở thành danh pháp khoa học chính
thức từ năm 1979 [4].

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng, hoa mọc ở giả
hành non lẫn giả hành đã trƣởng thành. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở
gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi, dạng này thƣờng sống ở
vùng có khí hậu nóng.
Về hình dạng của giả hành cũng rất đa dạng [7]:
- Nhóm có giả hành to ngắn, tận cùng thƣờng có 2-3 lá đài, bền, không
rụng. Phát hoa tập trung tại phần này tạo thành chùm có thể đứng hay thòng
nhƣ Thuỷ tiên trắng (D. fermeri), Vảy vá (D. lindleyi)…
- Nhóm giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành,
thƣờng rụng lá khi ra hoa nhƣ Hoàng thảo long tu (D. primulinum), Ý nhi (D.
gratiosissimum)…
- Nhóm giả hành rất mảnh mai có thể dài hay ngắn, có lá mọc dọc theo
chiều dài của chúng và các lá này thƣờng bền, không rụng. Hoa thƣờng chỉ
mọc ở nách lá nhƣ Hƣơng duyên (D. revolutum)…
1.1.2. Vài nét về lan Hoàng thảo ý ngọc
Lan Hoàng thảo ý ngọc có tên khoa học là D. transparens Wall. ex
Lindl. thuộc chi Dendrobium nên mang hầu nhƣ tất cả các đặc điểm của chi.
Hoàng thảo ý ngọc có thân thòng, lá mỏng. Hoa to 3-4 cm, 2-3 chiếc
mọc ở các đốt của thân cây đã rụng lá. Độ bền của hoa từ 12-20 ngày. Đài hoa
màu trắng tính khiết, lƣỡi tím hoa bèo. Màu sắc hoa biến thiên từ tím đến

5


trắng; cánh và lƣỡi pha màu rất hài hoà.
Loài này thƣờng dễ trồng, ra hoa vào mùa xuân (phổ biến tháng 4), có
hƣơng thơm lạ, nhẹ. Đây là loài đặc hữu của Sơn La, Điện Biên, Lai Châu.
1.2. Đặc điểm sinh học của cây lan
Với 750 chi và 20.000-25.000 loài (Takhtajan, 1987), họ lan đã chiếm
vị trí thứ 2 sau họ Cúc (Asteracea) trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn

Dichaea…
1.2.1. Hạt lan
Hạt lan rất nhỏ (nhƣ hạt bụi) và hầu nhƣ không chứa bất kỳ dinh dƣỡng
dự trữ nào cho phôi trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nảy mầm nhƣ các
loài thực vật khác. Cấu tạo hạt rất đơn giản, chỉ bao gồm một phôi chƣa phân
hoá đƣợc bao bọc bởi một lớp áo hạt. Trên thực tế, quả phong lan chứa một số
lƣợng rất lớn hạt lan, mỗi quả chứa trên một triệu hạt [30].
Phôi của các loài thực vật thuộc họ lan có kích thƣớc rất nhỏ và chƣa
phân hoá. Quá trình phát triển của phôi hạt lan rất khác biệt với các loài thực
vật có hoa khác [38].
Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu→ dạng thuỷ lôi→ dạng có lá mầm.
Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu→ dạng khiên→ dạng diệp tiêu.
Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu→ dạng chuyển tiếp→ dạng protocorm.
1.2.2. Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan
Vì hạt lan quá nhỏ, hầu nhƣ không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi
chƣa phân hoá nên k thể phát triển theo cách bình thƣờng đƣợc. Vì vậy việc
làm cho hạt lan nảy mầm và phát triển thành cây lan trƣởng thành là vấn đề
khó khăn vào giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển ngành lan [1].
Ngƣời trồng lan đã tìm mọi cách để gieo hạt nhƣng không thành công.
Năm 1844, Neumann đã làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách rải các hạt
lan trên các diện tích đất quanh gốc của các cây lan lớn. Dominy là ngƣời đầu
tiên đã tạo ra đƣợc các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan trƣớc năm

7


1853, nhƣng chỉ thành công ở một số giống [14].
Năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật ngƣời Pháp đã khám phá ra bí
mật của việc nảy mầm ở hạt lan khi ông khảo sát các hạt lan Neottia nidus nảy
mầm tự nhiên trong rừng vùng Fontainebleu ở Pháp. Ông thấy các cây lan con

của Anoectochilus formosanus cho thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm vào
lớp áo hạt. Sau khi hấp thu nƣớc, phôi trƣơng phồng và làm rách lớp áo hạt.
Phôi làm vỡ tung lớp áo hạt, nhú phôi sẽ hình thành trên một đầu protocorm
và mô phân sinh đỉnh trên đầu còn lại. Trên mặt cắt dọc của protocorm cho
thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm [25].
1.2.3. Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan
Năm 1922, Knudson đã thành công trong việc thay thế nấm bằng
đƣờng ở môi trƣờng agar để gieo hạt. Với các bình cấy có môi trƣờng agar và
muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt lan là rất ít hay không
có, nhƣng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan lại rất lớn [7]. Sự khác biệt
giữa cây lan và hạt lan là sử dụng CO2 trong không khí. Từ CO2 và nƣớc, cây
lan tạo thành carbohydrate trong quá trình quang hợp theo phản ứng:
nCO2+nH2O→(CH2O)n +nO2
Từ carbohydrate và muối khoáng hấp thu từ rễ, cây lan đã tạo ra đƣợc
các chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển. Hạt lan không nảy mầm đƣợc là
do chƣa có khả năng tổng hợp carbohydrate từ CO2 và không có nguồn
carbohydrate dự trữ. Thí nghiệm kiểm tra cho thấy chỉ cần thêm 2% đƣờng
vào môi trƣờng gieo hạt chỉ gồm có agar và muối khoáng, không cần có nấm
hạt lan vẫn nảy mầm tốt. Nhƣ thế vai trò chủ yếu của nấm đối với sự nảy
mầm của hạt lan là cung cấp nguồn carbohydrate. Từ đó phƣơng pháp của
Knudson đã đƣợc sử dụng khắp nơi trên thế giới và đƣợc gọi là phƣơng pháp
gieo hạt không cộng sinh (semis asymbiotique) [7], [38].
1.3. Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới
Trong những năm qua, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất mạnh

9


mẽ, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang trở thành một công cụ hiệu quả

2003) [34].
Từ 2000 đến 2002, Chen và cộng sự đã kết luận môi trƣờng ½ MS bổ
sung 10-20 g/l saccharose, 170 mg/l NaH2PO4 và 0,5 g/l peptone là thích hợp
nhất cho sự hình thành phôi trực tiếp từ mẫu lan Onncidium Gower Ramsey
[22], [23], [24].
Năm 2009, José Geraldo và Rezende nghiên cứu ảnh hƣởng các nồng độ
khác nhau của saccharose và GA3 đến sự phát triển protocorms từ hạt nảy mầm
của phong lan Cattleyaloddigesii sp. đã đi đến kết luận nồng độ 0 mg M-1GA3
và 60 mg M-1 saccharose cho số rễ và sự phát triển rễ non Cattleya loddigesiis
tốt nhất [35], [48].
Maridass M. và cộng sự (2010) đã tiến hành nhân giống in vitro chồi rễ
của loài Dendrobium nanum. Các chồi rễ đƣợc cấy lên môi trƣờng cơ bản có
bổ sung các chất KTST nhƣ KIN, BAP, NAA. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
sau 3-4 tuần các chồi rễ cảm ứng tạo thành callus và môi trƣờng tối ƣu cho tỷ
lệ tạo callus cao nhất là tổ hợp môi trƣờng bổ sung 2,0μM NAA và 1,2μM
KIN. Sau 12 tuần, các chồi đƣợc tạo thành và môi trƣờng tối ƣu cho sự phát
triển của chồi là môi trƣờng bổ sung 0.5μM BAP, chồi đạt chiều cao tốt nhất
là 15.78 mm [39].
Dai Chuan Yun et al. (2011) đã nghiên cứu và xác định đƣợc môi
trƣờng tối ƣu cho nhân nhanh protocorm lan Dendrobium candidum Wall. ex
Lindl. là 1/2MS + 6-BA 2mg/l + αNAA 0,5mg/l + KIN 1mg/l. Nghiên cứu
này đã cung cấp cơ sở khoa học cho sản xuất ở quy mô công nghiệp
protocorm và nhân giống chất lƣợng cao D. candidum [27].
Sana Asghar et al. (2011) đã nghiên cứu và xác định đƣợc môi trƣờng
có bổ sung 2ml/l BAP cho nhân nhanh chồi in vitro Dendrobium nobile [17].
S. Tuhuteru et al. (2012) nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nƣớc dừa

11




+ 0,5 mg/l BAP + 1,2 mg/l KI; MS + 2 mg/l BAP + 1,2 KI; MS +1,5 mg/l
BAP + 0,9 mg/l KI [8].
Tóm lại, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thu thập, lƣu giữ nguồn
gen hoa lan bản địa và nhập nội cũng nhƣ đánh giá, tuyển chọn những giống
phong lan triển vọng cho sản xuất và đi sâu nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật
về giá thể, phân bón, kỹ thuật điều khiển ra hoa, phòng trừ sâu, bệnh hại...
Các kết quả nghiên cứu đƣợc ứng dụng vào sản xuất đã bƣớc đầu đem lại hiệu
quả tích cực trong việc phát triển ngành trồng lan ở Việt Nam. Tuy nhiên các
nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở một số đối tƣợng và chƣa hoàn thiện đƣợc quy
trình kỹ thuật trồng, chăm sóc đầy đủ, đặc biệt là trên chi lan Dendrobium.

13


Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi là lan Hoàng thảo ý ngọc (D.
transparens Wall. ex Lindl) thuộc:
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Monocotyledoneae
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Chi: Dendrobium
Vật liệu nghiên cứu là Quả lan Hoàng thảo ý ngọc (D. transparens
Wall. ex Lindl) do Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN,
ĐHSP Hà Nội 2) cung cấp.
2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 1/2016 đến tháng 4/2017 tại Phòng
thí nghiệm Sinh lý học thực vật - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.

nƣớc javel 5% trong 10 phút. Sau đó bổ dọc quả, lấy hạt đặt vào đĩa petri
sạch, khử trùng bề mặt bằng khí clo (100 ml NaClO+3,3 ml HCl đặc) trong 2
giờ, hạt đƣợc gieo lên môi trƣờng MS. Sau 8-10 tuần hạt nảy mầm đƣợc sử
dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô thực vật.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc
lại. Mẫu sau khi cấy đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC, cƣờng độ
chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 h/ngày. Gồm các thí nghiệm:
2.6.1. Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm
Sử dụng hạt lan nảy mầm sau 10 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS
(Murasige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trƣởng KIN

15


(0,0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) để nghiên cứu khả năng nhân nhanh protocorm.
Theo dõi chỉ tiêu: đƣờng kính cụm protocorm (cm), số protocorm/cụm
sau 10 tuần nuôi cấy.
Sử dụng protocorm từ thí nghiệm trên để nuôi cấy trên môi trƣờng MS
có bổ sung thêm nƣớc dừa (ND): 0%; 5%; 10%; 15%; 20% (v/v) để nghiên
cứu khả năng tạo chồi in vitro từ protocorm.
Theo dõi tỷ lệ phần trăm tạo chồi từ protocorm sau 10 tuần nuôi cấy.
2.6.2. Nhân nhanh chồi in vitro:
Sử dụng chồi in vitro 10 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ
sung riêng rẽ các chất điều hoà sinh trƣởng thuộc nhóm KIN và BAP: 0,0;
0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l) và môi trƣờng cơ bản MS bổ sung tổ hợp BAP (0,52,0 mg/l) kết hợp NAA 0,2 mg/l.
Theo dõi số chồi/mẫu, số lá/chồi và chiều cao chồi (cm) sau 8 tuần
nuôi cấy.
2.6.3. Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh:
Chồi in vitro 2 tháng tuổi có chiều cao 4-5cm đƣợc nuôi cấy trên môi