Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TỐNG XUÂN HOA NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY
(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm
Thái Nguyên - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

i LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình

văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Thái nguyên, tháng 8 năm 2014
Tác giả luận văn
Tống Xuân Hoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv
Danh mục các bảng. v
Danh mục các hình vi
MỞ ĐẦU 1

trưởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 26
3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm 26
3.1.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh
trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 29
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi
Sâm dây trong ống nghiệm 30
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm
Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả
năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32
3.3.1. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự
sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32
3.3.2. Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân
chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong
ống nghiệm 33
3.3.3. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng
nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây
trong ống nghiệm 35
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trưởng của cây con trong vườn ươm 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT



vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Cây Sâm dây 3
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của
chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 27
Hình 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng
của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 30
Hình 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 31
Hình 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến khả năng nhân chồi và sự
sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 33
Hình 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của kinetin và IBA khả năng nhân chồi, sự sinh
trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 34
Hình 3.6. Ảnh hưởng kết hợp của BAP , kinetin, IBA đến khả năng nhân chồi
và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 36
Hình 3.7. Cây Sâm dây đưa ra môi trường tự nhiên (sau 4 tuần) 38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1 MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

- Xác định được giá thể đưa cây ra trồng ngoài môi trường tự nhiên.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng
thuộc nhóm Cytokinin lên khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây
Sâm dây trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi cây Sâm
dây trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các chất kích thích sinh trưởng
thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của
chồi và khả năng ra rễ của cây Sâm dây trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu giá thể và các điều kiện thích hợp để đưa cây ra môi trường
tự nhiên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Sâm dây
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây
Cây Sâm dây có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,
tên thường gọi: Đảng sâm, Vú chó, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm, Đảng sâm
nam, cây Đùi gà, Mằn rầy cấy (Tày), Cang hô (Mèo)
Sâm dây thuộc Chi Codonopsis.
Họ Hoa chuông (Campanulaceae).
Bộ Hoa chuông (Campanulales).
Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Ngành Hạt kín (Magnoliophyta)

đối, có cuống, phiến lá mỏng, hình tim hoặc gần hình trứng, dài 2,0cm - 5,0cm,
rộng 1,5cm - 3,5cm, mép lá khía răng cưa, mặt trên lá màu xanh nhạt, mặt dưới
màu trắng xanh. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hình chuông, màu trắng, hoặc hơi
vàng, họng có vân tím. Lá đài 5, hình mác nhọn. Tràng hoa chia thành 5 thùy
tam giác nhọn. Nhị 5. Bầu 5 ô. Quả nang, có núm, khi chín màu tím đen. Hạt
nhiều, nhỏ, màu vàng nâu [16].
1.1.2
a)
-
- 70 cm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

5
-
.
3 -
[6], [28].
Ngoài ra có thể trồng Sâm dây bằng đầu củ (sau khi thu hoạch rễ củ, bỏ
dây, cắt lấy phần đầu củ làm giống). Cây có thể lụi vào mùa đông hoặc mùa
khô (đối với các tỉnh phía nam). Đến mùa xuân hoặc đầu mùa mưa, từ gốc mọc
lên 1 - 2 chồi và sinh trưởng rất nhanh [16].
b)
. Khi cây lên cao 3 - 4
2 -
5 -
. Khi cây cao 1 -
- vôi theo tỷ lệ
0,2 - 1 - .
0,5 -

3,12%. Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã công bố về hàm lượng đường khử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

7
khoảng 14,6% đối với các mẫu cây sống, và 29,5% đối với các mẫu đã qua
chế biến [3].
1.1.3.2 Giá trị dƣợc liệu của cây Sâm dây
Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, lang y đã biết dùng củ sâm phơi khô để
dùng trong các bài thuốc chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe. Ngày nay, với sự phát
triển của khoa học, con người đã biết tách chiết riêng những thành phần có tính
chất dược trong củ sâm tạo thành thuốc. Công nghệ tách chiết hoạt chất đã giúp
cho việc không phải sử dụng nguyên củ sâm cùng những thành phần không có
công dụng chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khoẻ.
Các loài sâm nói chung cũng như Sâm dây nói riêng chứa rất nhiều hoạt
chất sinh học. Các hoạt chất này có nhiều tính chất dược và được sử dụng nhiều
để làm thuốc. Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như: terpen, acid
amin, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid và hợp chất
saponin là hoạt chất chính tạo nên những công dụng của nhân sâm [3].
Củ sâm đất có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng, làm long đờm , nhưng với
liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi. Dân gian thường lấy củ sâm
đất ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể, làm mát gan. Canh
rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi, nhưng không có
nhớt. Sâm đất có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêm khớp nó giúp
giảm viêm sưng và giảm đau. Sâm đất còn giúp giảm táo bón. Dùng sâm đất
giúp giảm cơn ho và suyễn; dùng cho một số trường hợp nam giới bất lực. Sâm
đất được dùng nhiều trong những bệnh về da như ghẻ; dùng làm bài thuốc trị
giun sán; dùng trong bệnh sỏi thận, viêm thận; giải độc cho gan. Bộ phận dùng
toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ: Lá có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít
độc (gây nôn nếu dùng liều cao). Rễ có vị ngọt, cay, tính mát. Công dụng:

15g, hầm với thịt gà ăn. Hoặc dùng Sâm dây, trái vẩy ốc (tức “quả xộp”), mỗi
vị 30g, sắc uống.
(4) Chữa khí hư: Dùng Sâm dây, rễ bùng bục, mỗi thứ 15g, hải phiêu tiêu
(mai cá mực) 24g, rễ rau dền gai 30g, sắc nước uống mỗi ngày trong một tháng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

9
(5) Chữa trẻ nhỏ đái dầm: Dùng Sâm dây 20 - 30g, thịt lợn nạc 50 -
100g, hầm chín ăn (uống nước canh, ăn thịt).
(6) Chữa trẻ nhỏ cam tích: Dùng Sâm dây 15g, thịt lợn nạc 50 – 70g,
cùng hầm chín, chia ra ăn trong ngày [13], [31].
1.2. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính
của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm
sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu
thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp
đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch
bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1].
Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau:
(1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công
tác chọn giống.
(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống
các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây
cảnh, cây dược liệu…
(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc
làm sạch bệnh virus.
(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm
tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai.
(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong

C
trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%.
Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành
trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [21].
Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô
phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của
cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống cây
trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp
thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm
đồng nhất về mặt di truyền. Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn
toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong
tự nhiên [21].
Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:
Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy
được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của
đỉnh sinh trưởng [1]. Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

11
rất khó thành công. Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là
làm sạch virus cho cây trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh
sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm [21].
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương
quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi
vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi
cũng giảm. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng,
hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng.
Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một

vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được. Các bộ phận đó là:
Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh… mảnh lá ở thuốc lá, cà
chua, bắp cải cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…
và nhánh củ ở tỏi, hành…
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo:
Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh
trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà
cây cũng khá đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô
nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo
khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó nhất thiết
phải sử dụng các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây
tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch
virus [14], [21], [26].
1.2.2. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai
đoạn sau [26]:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng
của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ
thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

13
mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non… Mô chọn để
nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch
bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Tùy
theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng [26].
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn

nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác
để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực
tiếp ra đất. Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần [26].
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng
thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng
ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro. Đối với một số loài có thể chuyển
cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau
khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm.
Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc
đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm
với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che
cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm
mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không
chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [26].
1.3. Chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật
Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất
cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy vậy,
yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm
lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và
nhóm cytokinin [9], [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

15
1.3.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol

16
những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như
IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả
năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [12].
Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự
phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo
rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric
axit), IAA (3-indol axetic axit), NAA (naphthalen axetic axit), 2,4-D (2,4-
dichlorophenoxy axetic axit). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử
dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra
chồi. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [12].
1.3.2. Cytokinin
Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát
hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô. Ngoài ra
còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,
chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta
thu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN [12].
Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là
một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm
1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA
được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng
độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [12].
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi
và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng
tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần
của các glycoside [12].
Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,
đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin
điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN
khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái