TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

----------

NGUYỄN THỊ HỒNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA TỪ CHÈ
TÂN TRÀO, TUYÊN QUANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN

Từ những kết quả đạt được này, em xin chân thành cám ơn:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động
viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để
em thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà
Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.

Lý do chọn đề tài ..................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .............................................. 2
5.1. Ý nghĩa khoa học.............................................................................................. 2
5.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 2
6. Điểm mới của đề tài ............................................................................................ 3
NỘI DUNG ............................................................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
1.1. Tổng quan về kombucha .................................................................................. 4
1.1.1. Sơ lược về kombucha .................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ........................................................................................... 5
1.2. Tổng quan về nguyên liệu ................................................................................ 6
1.2.1. Hệ vi sinh vật trong kombucha ..................................................................... 6
1.2.1.1. Vi khuẩn acetic ........................................................................................... 6
1.2.1.2. Nấm men .................................................................................................... 7
1.2.1.3. Vi khuẩn lactic ........................................................................................... 8
1.3. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ......................................... 11
1.4. Thành phần và công dụng của kombucha ...................................................... 14
1.4.1.Thành phần kombucha ................................................................................. 14
1.4.2. Công dụng của kombucha ........................................................................... 15
1.5. Nguồn nguyên liệu trà Tân Trào, Tuyên Quang ............................................ 17
1.6. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................... 18
1.6.1. Trên thế giới ................................................................................................ 18


1.6.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất .................................................... 20

3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả năng lên men Kombucha 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 47
1. Kết luận ............................................................................................................. 47
2. Kiến nghị ........................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 48


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Lớp màng kombucha ............................................................................... 6
Hình 1.2. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men .................................... 11
Hình 3.1. Dịch trà kombucha ................................................................................ 31
Hình 3.2: Chủng có hoạt tính catalaza âm tính ..................................................... 35
Hình 3.3: Chủng có hoạt tính catalaza dương tính................................................ 35
Hình 3.4. Chủng sinh acid lactic ........................................................................... 37
Hình 3.6. Kombucha lên men từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. ........ 39
Hình 3.7. Hàm lượng acid tổng số chủng vi khuẩn Lctobacillus.......................... 40
Hình 3.8. Kombucha ở các hàm lượng đường khác nhau ..................................... 42
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ........................... 42
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi acid tổng số ........................................ 43
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn chất lượng cảm quan của sản phẩm ở các hàm lượng
đường khác nhau ................................................................................... 43
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ......................... 45
phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2SO4 ................................................... 45
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ......................... 45
phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2SO4 ................................................... 45
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn chất lượng cảm quan của sản phẩm phụ thuộc vào
hàm lượng (NH4)2SO4 ........................................................................... 46


DANH MỤC BẢNG


5. Nxb

Nhà xuất bản

6. TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cùng với xu hướng phát triển mới, khi vấn đề sức khỏe con người được
đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi với thiên nhiên ngày càng
được ưa chuộng. Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ưu thế.
Đối với người Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi. Đã có
nhiều loại thức uống được chế biến từ trà nhưng sản phẩm trà lên men thì hầu
như còn mới đối với người Việt Nam.
Trà "thủy sâm", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm
trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủy
hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại men (giống như men giấm),
được nuôi trong dung dịch nước trà đường. Lọc nước (trà giấm) để uống. Do
dễ uống nên được dùng như một loại nước giải khát.
Trà lên men Kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các
nước Đông Âu, nó được biết đến là một loại đồ uống có lợi cho sức khỏe.
Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa
nấm men và vi khuẩn. Trên thế giới, kombucha được sản xuất trên quy mô
công nghiệp và đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan. Ở Việt
Nam đã có bán các loại kombucha dưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giải
khát nhập khẩu từ nước ngoài.... Lên men kombucha tại các hộ gia đình mới

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men kombucha từ chè Tân Trào,
Tuyên Quang
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm ra một số chủng vi kuẩn lactic có khả năng lên men kombucha thơm
ngon, bổ dưỡng trên môi trường nước chè đường.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn

2


Sử dụng chè Tân Trào, Tuyên Quang lên men kombucha tạo ra sản phẩm
mới, góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng
cao của người tiêu dùng. Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến
lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng, có lợi cho sức khỏe con người.
6. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn lactic L1 và L4 có khả năng lên
men Kombucha từ chè Tân Trào, Tuyên Quang tốt. Xác định được nguồn
dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men như hàm lượng đường 100 (g/l)
hàm lượng (NH4)SO4 2 (g/l).

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về kombucha
1.1.1. Sơ lược về kombucha
Trà kombucha là một sản phẩm được bắt nguồn từ phương Đông. Loại

đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường. Các vi khuẩn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh.
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo
Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi
sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter
như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…
và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có
thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium
gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là
Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Kombucha
còn được gọi là nấm trà. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà
đường. Bởi vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nên
gọi là nấm trà. Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng
mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một
kombucha thứ hai (thường gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban
đầu. Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

5


Hình 1.1. Lớp màng kombucha
1.2. Tổng quan về nguyên liệu
1.2.1. Hệ vi sinh vật trong kombucha
Hệ vi sinh vật lên men kombucha là một tập đoàn vi sinh vật cộng sinh
bao gồm các loài vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, giống Lactobacillus, các
loài nấm men. Nhưng chủ yếu là vi khuẩn Acetobacter và nấm men [28], [29].
1.2.1.1. Vi khuẩn acetic
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng

trung bình: chiều dài: 9 ÷ 10 µm, chiều rộng: 2 ÷ 7 µm. Hình dạng và kích
thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có hai hình thức sinh sản chủ yếu: sinh sản hữu tính bằng cách
hình thành bào tử túi và sinh sản vô tính bằng nảy chồi [20]. Nấm men là vi
sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung
cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Nấm men có thể tồn tại trong
cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí với khoảng nhiệt độ tương đối rộng, pH acid
thích hợp cho sự phát triển của nấm men [20].

7


Phân loại: Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men
giả (Fungi imperfecti) . Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men
dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống
Saccharomyces, giống Endomyces, giống Schizosaccharomyces. Lớp nấm
men giả (Fungi imporfecti), Crytococus (toscula, tornlopsis), Mycoderma,
Candida, Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc), Rhodotorula. [20]
1.2.1.3. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc
nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối
giống nhau. Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không
tạo bào tử, không di động, hô hấp tùy tiện ( kị khí và hiếu khí ) không chứa
các men hô hấp như xitocrom và catalaza. Chúng thu nhận năng lượng nhờ
quá trình phân giải hydrat cacbon và sinh ra axit lactic, sinh sản bằng hình
thức phân đôi tế bào.
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung vào

monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza,
maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng
cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu
cơ.
- Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất
chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men

9


là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy
mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
- Nhu cầu về Vitamin:
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của
tế bào nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên đa số các loài vi khuẩn
lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi
trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước
chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt …
- Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất
hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ.
Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của
vi khuẩn lactic như axit xitric, axit oleic, nên hiện nay người ta sử dụng các
muối xitrat, dẫn xuất của axit oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân
lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.



Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2. Quá trình
lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự
có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển
đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh
dưỡng và sử dụng các enzym sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học
trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2). Sau
khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa
theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất
này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ
được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng
glycerol sinh ra tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những
sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Sự chuyển hóa đường glucose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men
thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những
hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ


Streptococcus, chúng phân giải cacbonhydrat theo con đường EMP (Embden
– Meyrhof – Parnas) và bằng con đường này acid lactic sinh ra chiếm 90 –
98% và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl….

13


Phương trình tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình:
C6H12O6 →

2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

* Lên men lactic dị hình: Là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có
các sản phẩm khác như axit axetic, etanol, CO2,… Các vi khuẩn tham gia vào
quá trình lên men này thuộc các chi: Leuconostoc, Bifidobacterium. Do vi
khuẩn lên men lactic dị hình thiếu hai enzym chủ yếu của con đường EMP là
aldolase và triozophosphat izomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phân
giải glucose theo con đường PP (Pentose phosphat) [20]. Sau đó quá trình
chuyển hóa triozophosphat thành axit lactic xảy ra tương tự như lên men đồng
hình. Phương trình tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình:
C6H12O6 →

CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH +

C2H5OH + CO2
1.4. Thành phần và công dụng của kombucha
1.4.1.Thành phần kombucha
Trà kombucha có thể chứa các thành phần như: acid acetic, acid
butyric, acid gluconic, acid glucuronic, acid lactic, acid malic, acid oxalic,...
nhiều enzyme có lợi và vitamin nhóm B ( B1, B2, B3, B6, B12).


Caffeine

0,065

g/l

Vitamin B1

0,74

g/l

Vitamin B6

0,52

g/l

Vitamin B12

0,84

g/l

Vitamin C

1,51

g/l

15


1.4.2.3. Tăng thêm năng lượng
Kombucha có thể tiếp thêm sinh lực con người nhờ sự hình thành của
chất sắt trong quá trình lên men trà đen. Nó cũng chứa một lượng rất nhỏ
caffeine và vitamin B có khả năng tăng năng lượng cho cơ thể.
Kombucha giàu chất sắt có thể giúp tăng lượng hemoglobin trong máu,
cải thiện nguồn cung cấp oxy đến các mô và kích thích quá trình sản xuất
năng lượng ở cấp độ tế bào. Nói cách khác, bằng cách giúp cơ thể tạo ra nhiều
năng lượng (ATP), loại trà cổ xưa này còn có thể giúp những người thường
xuyên uống nó tràn đầy sinh lực.
1.4.2.4. Tăng cường miễn dịch
Kombucha có thể kiểm soát các gốc tự do thông qua các biện pháp
chống oxy hóa, nhờ đó giúp tăng cường miễn dịch. Bởi lẽ, stress oxy hoá làm
suy yếu hệ thống miễn dịch nhưng sẽ bị triệt tiêu nhờ một chất chống oxy hóa
mạnh mẽ được gọi là acid D -Arabino-1,4-lactone (DSL) đã được phát hiện
trong quá trình lên men Kombucha. Các nhà khoa học cho rằng DSL và các
vitamin C hiện diện trong Kombucha chính là bí mật giúp nó chống lại các
tổn thương tế bào, chống viêm, các khối u và trầm cảm.
1.4.2.5. Tốt cho xương khớp
Kombucha có thể giúp chữa lành, sửa chữa và ngăn ngừa tổn thương
xương khớp theo nhiều cách: Kombucha kết hợp các glucosamine làm tăng
sản xuất acid hyaluronic, hỗ trợ việc duy trì các collagen và ngăn ngừa cơn
đau do viêm khớp. Bên cạnh đó, nó cũng hỗ trợ sản xuất collagen trên toàn bộ
cơ thể và làm giảm sự xuất hiện của các nếp nhăn.
1.4.2.6. Phòng chống ung thư
Kombucha cũng có lợi trong việc phòng chống ung thư và tăng khả
năng phục hồi sức khoẻ ở các bệnh nhân mắc bệnh này. Uống Kombucha
thường xuyên giúp ngăn chặn sự phát triển ung thư ở giai đoạn đầu nhờ