TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
----------
ĐINH THỊ TUYẾT
TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ CHÈ NGỌC THANH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung
HÀ NỘI, 2015
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại
hoc Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời
gian học tập và nghiên cứu đề này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
năm 2015
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ....................................................................... 2
4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................. 2
5. Điểm mới của đề tài ................................................................................................... 2
NỘI DUNG. CHƢƠNG 1 ................................................................................................. 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3
1.1.1. Quá trình lên men kombucha ........................................................................ 4
1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha ..................................................... 5
1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ....................................................... 6
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè................................................ 6
1.2.1.2. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................... 7
1.2.2. Hệ vi sinh vật ............................................................................................... 8
1.2.2.1. Giống vi khuẩn Acetobacter .................................................................. 9
1.2.2.2. Giống vi khuẩn lên men lactic ........................................................... 10
1.2.2.3. Nấm men ............................................................................................ 11
1.3.1. Trên thế giới............................................................................................... 12
1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................ 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 17
2.1.1. Mẫu thực vât .............................................................................................. 17
2.1.2. Mẫu vi sinh vật........................................................................................... 17
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 17
2.1.4. Hóa chất và các loại môi trƣờng ................................................................. 17
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến lên men kombucha.......................... 40
3.3.1. Nhiệt độ lên men ........................................................................................ 40
3.3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men kombucha ............ 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 45
1. Kết luận .................................................................................................................. 45
2. Kiến nghị ................................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 46
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà ............................................................................. 8
Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...... 18
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ................. 24
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu................................................. 25
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ........................ 23
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng phân lập đƣợc .......... 28
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ
dịch trà Kombucha từ chè Ngọc Thanh ....................................... 34
Bảng 3.3. Bảng hàm lƣợng acid tổng số và chất lƣợng cảm quan sản
phẩm của 9 chủng vi khuẩn ........................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả phân lập các chủng nấm men ........................................... 36
Bảng 3.5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men .................................... 37
Bảng 3.6. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm
men M1 ........................................................................................ 39
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sản phẩm trà Kombucha ................................................................. 3
Hình 1.2. Lá chè tƣơi...................................................................................... 7
Hình 3.1. Lá chè thu mẫu ............................................................................. 27
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
1. ATP
Adenozin triphotphat
2. STT
Số thứ tự
3. SCOBY
Symbiotic colony of Bacteria and Yeast
4. NADP
Nicotiamide adenine
5. Nxb
Nhà xuất bản
6. TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cùng với xu hƣớng phát triển mới, khi vấn đề sức khỏe con ngƣời đƣợc
chè Ngọc Thanh
3.2. Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến lên men kombucha
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm ra một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc chè đƣờng Ngọc
Thanh.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng lá chè xanh khu vực xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh
Vĩnh Phúc lên men kombucha phục vụ cho đời sống nhân dân, góp phần
nâng cao giá trị cây chè. Tạo ra sản phẩm mới góp phần làm đa dạng các sản
phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng
đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng,
có lợi cho sức khỏe con ngƣời.
5. Điểm mới của đề tài
Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn A1 và chủng nấm men M1 có thể
dùng cho lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh tốt. Nghiên cứu ảnh hƣởng
của nhiệt độ và hàm lƣợng đƣờng bổ sung cho dung dịch nƣớc chè Ngọc
Thanh lên men kombucha.
2
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về sản phẩm kombucha
Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nƣớc uống có lợi cho sức khỏe.
Đây là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm
lên men ethanol, nhiều axit hữu cơ đƣợc tạo thành. Một số axit hữu cơ đƣợc
sinh tổng hợp từ chu trình krebs nếu nhƣ quá trình lên men không diễn ra
trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các axit hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao
nhất trong dịch lên men là: axit citric, axit malic, axit acetic, axit lactic.....
Quá trình chuyển hóa ethanol thành axit acetic trong điều kiện hiếu khí
dƣới tác dụng của enzim oxy hóa của vi khuẩn gọi là lên men acetic. Lên men
acetic là quá trình oxy hóa tuần tự ethanol chuyển thành acetaldehyde dƣới
tác dụng của enzim alcohol dehydrogenase, rồi acetaldehyde đƣợc chuyển hóa
thành hydrate acetaldehyde và sau cùng hydrate acetaldehyde bị oxy hóa
thành axit acetic.
Lên men lactic đƣợc thực hiện bởi hệ enzim của các vi khuẩn họ
Lactobacteriaceae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí).
Phụ thuộc vào hệ enzim của từng nòi vi khuẩn trong môi trƣờng lên men hoặc
chỉ có axit lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài axit lactic còn có các sản
phẩm khác và CO2 (lên men dị hình).
4
1.2.2. Thành phần và công dụng của kombucha
Trà kombucha chứa nhiều loài vi sinh vật khác nhau cùng với các axit
hữu cơ thông thƣờng, enzim có lợi, amino axit và polyphenol. Phụ thuộc vào
các vi sinh vật, trà kombucha có thể chứa các thành phần nhƣ: acid acetic,
acid butyric, acid gluconic, acid glucuronic, acid lactic, acid malic, acid
oxalic,... nhiều enzyme có lợi và vitamin nhóm B ( B1, B2, B3, B6, B12).
Trong quá trình lên men yếm khí, trà kombucha chứa một lƣợng cồn khác
nhau từ 0,5 – 1,5% phụ thuộc vào thời gian lên men yếm khí và vi sinh vật.
Trà kombucha giúp tăng sức chịu đựng dẻo dai của cơ thể, làm giảm đau cơ,
triệu chứng mệt mỏi. Nhờ sản sinh axit lactic, giúp tăng lƣợng vi khuẩn có lợi
cho đƣờng ruột, tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, ngừa táo bón, nhiễm
cây chè. Từ lâu, cây chè và các sản phẩm từ chè đã rất gần gũi, phổ biến trong
đời sống của ngƣời dân Việt Nam.
Ngọc Thanh là xã miền núi duy nhất của thị xã Phúc Yên tỉnh Vĩnh Phúc.
Với địa hình trung du miền núi Bắc bộ, Ngọc Thanh tập chung vào gieo trồng
các loại cây có hiệu quả kinh tế cao. Trong đó, cây chè là một trong những cây
đƣợc chú trọng. Toàn xã có 470 mẫu chè, cho 500 tấn chè mỗi năm.
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè
Thời vụ
Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp
cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Hè Thu (tháng 5 - 10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng những
búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá , tháng 12 hái cả lá cá.
Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trƣởng đỉnh đều có thể hái
kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động.
6
Chu kỳ phát triển
Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là
giai đoạn cây non hay giai đoạn thiết kế cơ bản. Các bụi chè phải trồng 3-4
năm kể từ khi gieo trồng mới phát triển thành cây trƣởng thành. Sau đó là giai
đoạn cây lớn và giai đoạn cuối là giai đoạn chè già cỗi. Giai đoạn chè lớn kéo
dài 20 – 30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dƣỡng và khai thác. Chăm
sóc kém và khai thác nhiều sẽ làm cho cây chè bị suy thoái, già trƣớc tuổi.
Đây là giai đoạn chè cho năng suất cao nhất. Sau đó là giai đoạn chè già cỗi,
cây chè suy yếu dần, lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm
hƣơng nhiều, chồi gốc mọc nhiều.
(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)
8 - 12
(-) Epicatechin gallate (ECG)
3-6
(-) Epigallo catechhin (EGC)
3-6
(-) Epicatechin
1–3
(+) Catechin (C)
1-2
(+) Gallocatechin (GC)
3–4
Caffeine
3–4
Axit hữu cơ ( ctric, malic, oxalic,...)
Acetobacteriaceae chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc
điểm hình thái, sinh lý, dinh dƣỡng và đặc điểm sinh thái.
Đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái thƣờng đƣợc khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thƣớc tế
bào. Ngoài ra, số lƣợng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuẩn acetic.
Đặc điểm sinh thái
Giống vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể
phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm,
dấm, rƣợu, bia, hoa quả …. Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc
phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế.
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thƣờng gắn liền với các nguồn
dinh dƣỡng chứa đƣờng hay alcohol nhƣ các loại hoa, quả, bia, rƣợu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp, đặc điểm sinh thái
đƣợc đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể nhƣ
Acidomonas chỉ có thể phân lập đƣợc trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulibacter đƣợc tìm thấy trong cơ thể ngƣời bị u hạch.
9
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn Acetobacter có thể di động (có tiêm mao đơn hoặc chu mao)
hoặc không di động (không có tiêm mao), không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt
buộc, chịu đƣợc độ axit cao.
Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn
cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Có khả năng tạo váng
trên môi trƣờng lỏng.
Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton.
khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn
lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [6].
1.2.2.3. Nấm men
Hình thái và cấu tạo tế bào
Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích
thƣớc rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc trung bình: Chiều
dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thƣớc tế bào thay đổi,
không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện
nuôi cấy khác nhau.
Sự sinh sản của nấm men
Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh
sản đơn tính).
Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti).
Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống
Endomyces; Giống Schizosaccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc);
Rhodotorula [7].
11
Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành nấm túi (Ascomycota), một
số ít loài thuộc ngành nấm đảm (Basidimycota). Saccharomyces là một chi
nấm men đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm. Trên 1000 loài nấm
men đã đƣợc miêu tả, loài nấm men đƣợc con ngƣời sử dụng nhiều nhất là
Acetobacter. (NRRL B-2357) và 2 loại men (NRRL YB-4810, NRRL YB4882) từ mẫu Kombucha có nguồn gốc từ Thụy Sĩ và sử dụng các vi sinh vật
này để sản xuất trà Kombucha [22].
Hầu hết các vi khuẩn lên men kombucha thuộc chi Acetobacter và
Gluconobacter. Đa số là các vi khuẩn Acetobacter xylinum (Danielova 1954;
Konovalov và Semenova 1955; Sievers và những ngƣời khác 1995; Roussin
1996) [14], [25], [36], [38]. Chúng tạo ra một màng nổi cellulosic trên bề mặt
dịch lên men (Markov và et al 2001) [29]. Năm 1995, Sievers và cộng sự đã
công bố các chủng vi sinh vật trong lớp cellulose là cộng sinh của A. xylinum
và một sp Zygosaccharomyces [38]. Đa số các vi khuẩn acid acetic đƣợc tìm
thấy trong các loại nấm trà là A. xylium, A. pasteurianus, A. aceti, và
Gluconobacter oxydans (Liu và cộng sự 1996) [28]. Trong đó,
Gluconacetobacter sp. A4 (G. sp. A4), có khả năng tạo ra D-saccharic axit1,4-lactone (DSL) mạnh, là loài vi khuẩn đƣợc phân lập chủ yếu từ
Kombucha trong báo cáo của Yang và cộng sự (2010) [42]. Dutta và Gachhui
(2006, 2007) đã phân lập đƣợc vi khuẩn cố định đạm Acetobacter
nitrogenifigens sp, chủng có khả năng sản xuất cellulose mạnh là
Gluconacetobacter kombuchae sp. từ trà kombucha [16], [17].
Năm 2014, một cuộc điều tra của Marsh và cộng sự chỉ ra rằng các
chủng vi khuẩn chiếm ƣu thế trong 5 mẫu Kombucha (hai mẫu từ Canada,
một mẫu từ Ireland, một mẫu từ Mỹ và một mẫu từ Anh) là
Gluconacetobacter (trên 85% trong hầu hết các mẫu) và Lactobacillus (lên
đến 30%) loài. Acetobacter chỉ chiếm số lƣợng rất nhỏ (dƣới 2%) [30].
Ngoài vi khuẩn acid acetic có nhiều loài nấm men trong Kombucha.
Một loạt các nấm men đã đƣợc báo cáo bao gồm các loài thuộc chi
Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces,
13
Brettanomyces/Dekkera, Candida, Torulospora, Koleckera, Pichia, Mycotorula,
14
hệ vi sinh vật lên men kombucha. Đa phần các nghiên cứu tập chung vào thành
phần và công dụng của kombucha. Theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà
thủy sâm rất nhiều. Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát
triển dƣới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi
nhanh trong môi trƣờng nƣớc chè (trà) pha đƣờng. Thành phần trà kombucha
có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ [43]. Tuy nhiên theo
tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trƣởng Viện Y dƣợc học dân tộc thành phố Hồ
Chí Minh thì cho đến nay Viện cũng chƣa có công trình nào nghiên cứu về
thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [46].
Năm 2010, tác giả Thạc sĩ Trần Thị Ngọc Mai, trƣờng đại học Kỹ thuật
Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất
kombucha”. Trong nghiên cứu tác giả đã khảo sát điều kiện cộng sinh giữa vi
khuẩn và nấm men, các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly trà trong
nƣớc, quá trình thuần hóa hệ cộng sinh vi khuẩn, nấm men và các yếu tố ảnh
hƣởng tới quá trình lên men kombucha [9]. Năm 2013, tác giả Ngô Xuân
Cƣờng, Nguyễn Thị Bích Ngọc thực hiện đề tài “Nghiên cứu phƣơng pháp
lên men nƣớc giải khát từ chè xanh”. Trong đề tài, tác giả so sánh phép đo
nồng độ của chất tan trong một dung dịch chứa các chất tan của chè và đƣờng
saccharose cho thấy rằng phƣơng pháp làm bay hơi nƣớc sau đó cân cho kết
quả chính xác hơn so với đo bằng khúc xạ kế. Cấy thử nghiệm một chủng vi
khuẩn Komagatabacter kết hợp với 3 chủng nấm men Zygosaccharomyces
fermentati, Hanseniaspora pseudoguilliermondii, Dekkera bruxellensis vào
dung dịch chè và đƣờng saccharose, lên men ở nhiệt độ 25 – 27oC, thời gian
lên men 3-6 ngày, thu đƣợc dung dịch có độ chua – ngọt tƣơng tự kombucha [1].
Các công trình nghiên cứu về hệ vi sinh vật kombucha còn khá ít. Năm
2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự, Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh
đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả
Việt Nam còn khá ít. Các nghiên cứu chủ yếu ở quy mô nhỏ.
16
Copyright: Tài liệu đại học ©