TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Minh Phương


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật,
đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em. Tất cả những số liệu đều
được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số
liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình
nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác,
em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày…..tháng 04 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh Phương


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

1. TCN

: Trước công nguyên

2. VK

: Vi khuẩn


1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ................................................................ 3
1.1.1. Lịch sử về tảo xoắn Spirulina ................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm phân loại.................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của tảo xoắn................................................................ 4
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina .................................. 6
1.2. Vi sinh vật và quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn
Spirulina ............................................................................................................ 6
1.2.1. Vi khuẩn Lactic ....................................................................................... 6
1.2.2. Vi khuẩn giấm ......................................................................................... 8
1.2.3. Nấm men ................................................................................................. 9
1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên
men tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ................................................. 10
1.2.5. Cơ chế của quá trình lên men lactic ...................................................... 14
1.3. Ứng dụng của Spirulina ........................................................................... 14
1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm ................................................................... 14
1.3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường ......................................................... 15
1.3.3. Ứng dụng trong y học ........................................................................... 17
1.3.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm ..................................................................... 17


1.3.5. Ứng dụng tảo làm thức ăn cho vật nuôi ................................................ 18
1.4. Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn Spirulina hiện nay ........................... 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 22
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 22
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ............................................................... 22
2.2. Các loại môi trường.................................................................................. 23
2.2.1. Môi trường phân lập giống vi khuẩn lactic: MRS thạch (g/l) ............... 23

Hình 3.1. Dịch lên men từ bột tảo xoắn .......................................................... 29
Hình 3.2. Mẫu thử hoạt tính catalaza .............................................................. 33
Hình 3.3. Mẫu thử khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann ........ 34
Hình 3.4. Vòng phân giải CaCO3 của chủng Lactobacillus L5 ..................... 35
Hình 3.5. Khả năng lên màng của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 ............. 36
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau
trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật đã tuyển chọn. ............. 38
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol ................ 39
Hình 3.8. Sự biến thiên của hàm lượng đường sót ở các ................................ 40
hàm lượng giống bổ sung khác nhau .............................................................. 40
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men .............. 42
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và kích thước của vi khuẩn lactic trong các
mẫu phân lập ................................................................................................... 31
Bảng 3.2. Kích thước vòng phân giải của 9 chủng vi khuẩn Lactobacillus ... 35
Bảng 3.3. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus ................................................................................................... 36
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ............................. 46
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .............................................................. 46
Bảng 3.5. Sự biến đổi thành phần hóa học trong quá trình lên men ............... 46
tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ......................................................... 46


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến
quá trình lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men từ tảo
xoắn Spirulina để tạo nước giải khát.
3.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế
4.1 Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình lên men lactic để nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo Nước giải khát từ tảo
xoắn Spirulina.
4.2 Ý nghĩa thực tế
Là một trong những công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng lên men dịch tảo xoắn
Spirulina để sản xuất nước giải khát. Từ đó cho ra sản phẩm nước giải khát
đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng.
5. Đóng góp của đề tài
5.1. Phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic và dựa vào đặc điểm hình thái,
kích thước tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng xác định là vi khuẩn
Lactobacillus. Tuyển chọn được 1 chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 thích
hợp để lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina.
5.2. Tìm ra điều kiện môi trường thích hợp để lên men nước giải khát từ tảo
xoắn Spirulina đạt tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm với: nhiệt độ thích
hợp cho lên men 300C, thời gian lên men 5 ngày, hàm lượng giống bổ
sung 10%, pH thích hợp 4,5.



1.1.2. Đặc điểm phân loại
Tảo Spirulina là các vi sinh vật có hình xoắn sống trong nước mà ta
quen gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây
không phải là một sinh vật thuộc ngành Tảo (Algae) vì Tảo thuộc giới sinh
vật có nhân thật (Eukaryotes). Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam
(Cyanobactera), chúng thuộc giới sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không
phải thuộc chi Spirulina mà lại thuộc chi Arthrospira [14].
Về phân loại khoa học [14, 22], tảo Spirulina thuộc:
- Giới (domain): Bacteria
- Ngành (phylum): Cyanobactera
- Lớp (class): Chroobacteria
- Bộ (order): Oscillatoriales
- Họ (family): Phormidiaceae
- Chi (genus): Arthrospira
-

Loài (species): Anthrospira platensis

Vì có cấu tạo và chức năng khác các loài thông thường nên Spirulina
còn có tên là vi khuẩn lam hay phiêu sinh thực vật.
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của tảo xoắn

Hình 1.1: Tảo xoắn (Spirulina) dưới kính hiển vi
Tảo Spirulina là một loài vi tảo có dạng xoắn hình lò xo, màu xanh lam
với kích thước chỉ khoảng 0,25mm. Chúng sống trong môi trường nước giàu
4



hoặc glycogen hoặc hạt α là những polyme glucose, nhỏ, tròn và khuếch tán
rộng trong thylacoidal. Các hạt lipid, hạt β hoặc hạt osmophile từ cơ quan dự
trữ, được cấu tạo bởi poly-β hydroxybutyrate, chỉ tìm thấy ở trong các tế bào
prokaryote, chúng được coi như là những chất dự trữ năng lượng [14,5].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina
Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin.
Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có
hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn
so với nhiều loại thực phẩm. Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất. Ngoài ra,
.

Spirulina còn chứa các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox, 1986).
Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày.
Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam - lục là do
Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll,
phycocyanin, β - caroten. Caroten trong tảo Spirulina cao gấp 10 lần trong
củ cà rốt. Sắc tố tạo cho tảo có mầu xanh lam là phycocyanin [14].
1.2. Vi sinh vật và quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina
Hệ vi sinh vật lên men dịch tảo xoắn Spirulina là một tập đoàn vi sinh
vật cộng sinh bao gồm các vi khuẩn và nấm men.
1.2.1. Vi khuẩn Lactic
Phân loại khoa học
Giới
Ngành
Lớp
Loài
Họ
Giống

Vi khuẩn

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí Gram dương, có dạng hình que dài,
không sinh bào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động.
Chúng là nhóm chính của vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng
biến đổi đường lactose và những đường khác thành axit lactic. Chúng là vi
khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính. Ở người, chúng có mặt ở âm đạo
và ở ruột. Nhiều loài có ở thực vật đang phân rã. Sự sản xuất axit lactic làm
7


ngăn cản sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có hại khác [2], [5].
1.2.2. Vi khuẩn giấm
Vi khuẩn giấm là tác nhân chính của quá trình lên men acetic. Giống
vi khuẩn acetic, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể dễ dàng tìm thấy
các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm,
rượu, bia, hoa quả… Ngày nay người ta đã biết tới hơn 20 loài vi khuẩn có
khả năng lên men acetic thuộc nhóm khác nhau [1].
Về hình dạng tế bào vi khuẩn giấm là những trực khuẩn hình que hay
hình elip, hình chỉ, hình cầu hoặc có hình bán nguyệt, kích thước tế bào
thay đổi tùy loài (0.3 - 0.6 x 1.0 - 8.0μm). Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành chuỗi, có hoặc không có tiêm mao, sống và phát triển trong điều
kiện hiếu khí bắt buộc hóa dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử. Ở môi
trường dịch thể vi khuẩn giấm có sự hình thành màng trên mặt thoáng,
màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các loại màng
cũng khác nhau tùy loại [1].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi
khuẩn giấm rất phong phú. Nguồn carbon có thể được cung cấp từ các hợp
chất đường, rượu etylic và các acid hữu cơ. Vi khuẩn giấm có thể sử dụng
các muối amon làm nguồn cung cấp nitơ và phân giải pepton. Một số acid
amin như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S… cũng
có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Do đó bia,

bào không còn khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản
bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ [13].

9


1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo nước
giải khát từ tảo xoắn Spirulina
1.2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác
nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên
tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về
một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza,
lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng
cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm
men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên
ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất
của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài

và dẫn xuất, rượu, acid hữu cơ, acid amin… có thể là nguồn dinh dưỡng
carbon của nấm men, trong đó nguồn đường là chủ yếu. Nấm men có thể sử
dụng nhiều nguồn đường khác nhau như sucrose, maltose, lactose, glucose…
Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ
có khả năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ
hoặc vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid,
urê, nucleotit… Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat, acetat…

11


Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin
là nhân tố sinh trưởng cơ bản của nấm men.
1.2.4.2. Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông
qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn
lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
Lên men lactic đồng hình [1], [2]
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm
acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng
nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl….
Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

C6H12O6

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá
theo chu trình Embden - Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả
các loai enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat
dược chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không

photphoglycerinic để khử nó thành acid lactic.
CH2OP - CHO - COOH + H2O (PN-H2)

CH3CHOHCOOH + H3PO4+PN+ H2O

Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate - dehydrogenase
và sự có mặt của lactataxemase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D
(-), L (+) hoặc DL.
Lên men lactic dị hình[1], [2]
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm
acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,
etanol, acid succinic, CO2,…
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H12O6CH3CHOHCOOH+HOOC(CH2)COOH+CH3COOH+C2H5OH+CO2…
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%,
rượu etylic và acid acetic 10% các lọai khí 20%.... đôi khi không có các khí
mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản
phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị
hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình.
Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho
rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình.

13


1.2.5. Cơ chế của quá trình lên men lactic
Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kỵ khí làm
biến đổi các hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản
phẩm khác. Các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải
vào môi trường lên men còn các phân tử ATP được giữ lại trong tế bào để

gọi là thực dược hay thực phẩm chức năng [15]. Đặc biệt trong những
tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩm chứa tảo Spirulina đang bán
trong nhóm sản phẩm nêu trên được khá nhiều người chú ý. Thực phẩm
dinh dưỡng được dùng ở dạng nước uống, siro, yaourt, bột dinh dưỡng. Có
thể dùng tảo nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn như nấu canh, làm
bánh. Một số nước còn có trà Spirulina. Ở Đức, người ta đã bắt đầu đưa tảo
vào bia, gọi là bia xanh. Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 - 45g. Dùng
thừa cũng vô hại. Người bị bệnh nặng không ăn được có thể bơm tảo thẳng
vào dạ dày là đủ các chất dinh dưỡng. Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam
xuất hiện ở một số cửa hàng thực phẩm, siêu thị một số loại nước giải khát
nhập ngoại được tạo từ tảo xoắn Spirulina [15].
1.3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường
Từ năm 1975, Oswald và cộng sự tại trường Đại Học Tổng Hợp
Califonia đã thử nghiệm dùng Spirulina trong xử lý nước thải công nghiệp và
đi đến kết luận rằng: trong hệ xử lý nước thải Spirulina có vai trò tạo O2, tăng
độ kết lắng, loại trừ kim loại và các chất hữu cơ độc hại. Tảo Spirulina đang
được rất nhiều nước trên thế giới sử dụng để cải tạo nước, xử lý nước thải từ
các nhà máy, nước thải công nghiệp, nước ô nhiễm [15].
Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim loại nặng trong
nước thải công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ngại. Việc áp dụng
các biện pháp hóa lý như đã nêu thường có giá thành cao, khiến nhiều hoạt
động công nghiệp vẫn tiếp tục thải nước thải chứa kim loại nặng vào môi
trường. Vì vậy nghiên cứu sử dụng vi tảo để loại trừ kim loại nặng trong

15