BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

VŨ QUỲNH PHƯƠNG
Mã sinh viên: 1201467

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
GLYCEROL VÀ NỒNG ĐỘ TINH BỘT
ĐẾN CẤU TRÚC VÀ MẬT ĐỘ VI SINH
VẬT Lactobacillus acidophilus TRONG
VI NANG CALCI ALGINAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

VŨ QUỲNH PHƯƠNG
Mã sinh viên: 1201467

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
GLYCEROL VÀ NỒNG ĐỘ TINH BỘT
ĐẾN CẤU TRÚC VÀ MẬT ĐỘ VI SINH
VẬT Lactobacillus acidophilus TRONG
VI NANG CALCI ALGINAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn

Sinh viên
Vũ Quỳnh Phương


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………...……….1
Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Đại cương về probiotic ....................................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa ......................................................................................................... 2
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến ........................................................................... 2
1.2. Vi khuẩn lactic .................................................................................................... 3
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic ................................................................. 3
1.2.2. Loài Lactobacillus acidophillus ........................................................................ 4
1.3. Tổng quan về vi nang hóa probiotic ................................................................. 6
1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................................... 6
1.3.2. Đặc điểm của vi nang ........................................................................................ 6
1.3.3. Các phương pháp vi nang hóa ........................................................................... 7
1.3.4. Phương pháp nhỏ giọt đông tụ (Extrusion) ....................................................... 8
1.3.5. Alginat ............................................................................................................... 8
1.4. Đông khô ........................................................................................................... 10
1.4.1. Khái niệm ........................................................................................................ 10
1.4.2. Ưu nhược điểm của quá trình đông khô .......................................................... 11
1.4.3. Các tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô ............................... 12
1.5. Một số nghiên cứu về vi nang calci alginat đông khô chứa L. acidophilus . 14
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến số lượng VSV có trong vi nang
calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus trước đông khô. ................................. 29


3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến cấu trúc, số lượng VSV của vi
nang calci alginat chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô và độ ổn định trong
thời gian bảo quản. .................................................................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Chữ viết tắt
Alg

Alginat

Am

Amylose

Ap

Amylopectin

ATCC


kl/tt

khối lượng/thể tích

LAB

Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)

L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus

MRS

de Man, Rogosa, Sharpe
(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic)

MT

Môi trường

SEM

Scanning Electron Microscope
(Kính hiển vi điện tử quét)

TB

Tinh bột


Hình 3.1 Alginat – tinh bột .......................................................................................24
Hình 3.2 Alginat – TB – glycerol .............................................................................24
Hình 3.3 Bề mặt vi nang Alginat – tinh bột 10% .....................................................24
Hình 3.4 Bề mặt vi nang Alginat – TB 10% – glycerol ...........................................24
Hình 3.5 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – tinh bột 10%..........................................24
Hình 3.6 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – TB 10% – glycerol ................................24
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV trong vi nang calci alginat – TB 10% có
và không có glycerol .................................................................................................26
Hình 3.8 Số lượng VSV có trong vi nang calci alginat chứa L. acidophilus trước
đông khô ở các công thức khác nhau ........................................................................31
Hình 3.9 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5% (CT1) ................34
Hình 3.10 Mặt cắt ngang vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10% (CT2) ............34
Hình 3.11 Cấu trúc vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5% (CT1) .......................35
Hình 3.12 Cấu trúc vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10% (CT2) .....................35
Hình 3.13 Hình ảnh L. acidophilus trong vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 5%
(CT1) .........................................................................................................................35
Hình 3.14 Hình ảnh L. acidophilus trong vi nang Alginat – glycerol - tinh bột 10%
(CT2) .........................................................................................................................35
Hình 3.15 Kết quả hoạt độ nước của vi nang calci alginat – glycerol – tinh bột .....37
Hình 3.16 Số lượng L. acidophilus có trong vi nang calci alginat – glycerol – tinh
bột sau đông khô và trong thời gian bảo quản ở hai nồng độ tinh bột khác nhau ....39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Lactobacillus acidophilus là một vi khuẩn có lợi, được sử dụng nhiều làm
nguyên liệu trong các chế phẩm probiotic. Khi đưa vào cơ thể con người, probiotic
mang lại tác dụng kích thích tiêu hóa, điều trị rối loạn tiêu hóa, táo bón… [51]. Tuy
nhiên, trong quá trình chế biến và bảo quản, vi khuẩn dễ bị các tác động của môi
trường bên ngoài như độ ẩm, nhiệt độ, áp suất, pH… gây giảm số lượng vi khuẩn
sống sót [46]. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm tăng

vi sinh vật sống có tác dụng tốt trên vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng đường
ruột” [27].
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương thế giới
(FAO) đã đưa ra một định nghĩa ngắn gọn và đầy đủ về probiotic như sau:
“Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn sẽ
đem lại lợi ích cho vật chủ” [25]. Số lượng đủ lớn mà WHO đưa ra đó là vi sinh vật
phải ổn định trong chế phẩm trong suốt quá trình bảo quản, duy trì số lượng sống
sót ở mức tối thiểu là 106-107 CFU/g [13], [25]. Số lượng vi sinh vật vừa đủ đạt kết
quả thành công trên các thử nghiệm lâm sàng là từ 107-1011 CFU/ngày [28], [57].
1.1.2. Các chủng probiotic phổ biến
Tiêu chuẩn để lựa chọn giống probiotic như sau:
-

Nguồn gốc rõ ràng (chủng giống phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc
tế).

-

Không gây bệnh, không chứa độc tố (chủng phải được đánh giá xác định an
toàn và không có độc lực).

-

Dễ nuôi cấy.

-

Có đặc tính probiotic.

-


Lactococcus: chủ yếu là lên men đồng hình.

-

Streptococcus: lên men đồng hình.

-

Leuconostoc: lên men dị hình.

-

Pediococcus: lên men đồng hình [53].
Chi lớn nhất, Lactobacillus, bao gồm khoảng 100 loài. Các loài nổi bật dùng

để sản xuất các chế phẩm sữa lên men đó là L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L.
dulbrueckii, L. helviticus, L. johnsonii, L. plantarum, và L. rhamnosus [29]. Vi
khuẩn thuộc chi này thường phát triển tốt trong điều kiện acid với pH 3,5-5,0.
3


Trong môi trường thích hợp của từng loài, chúng có thể phát triển được ở ba mức
oxy: (1) kỵ khí, thiếu oxy; (2) vi hiếu khí, đòi hỏi mức oxy thấp; (3) kỵ khí tùy tiện,
có thể chuyển đổi giữa hiếu khí và kỵ khí. Lactobacillus là những vi khuẩn chí
thường sống trong đường tiêu hóa của người và các động vật khác [42].
1.2.2. Loài Lactobacillus acidophillus
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Lactobacillus acidophilus là loài vi khuẩn nằm trong chi Lactobacillus, là chi
lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, họ vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong các chế

1.2.2.3. Các chế phẩm hiện nay
Hiện nay trên thị trường, L. acidophilus được sử dụng rộng rãi làm chế phẩm
probiotic giúp điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa như:
Chế phẩm men vi sinh Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn
Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống. Mỗi gói chứa 75mg L.
acidophilus tương đương với 108 CFU, giúp điều trị trường hợp viêm ruột non, tiêu
chảy do nhiễm khuẩn, rối loạn tiêu hóa do ngộ độc thức ăn và dùng kháng sinh lâu
ngày.
Men vi sinh Biolactomen do viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
sản xuất dưới dạng lọ bột đông khô pha hỗn dịch uống có chứa khoảng 108 CFU L.
acidophilus, giúp hỗ trợ điều trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, ngộ độc thực phẩm,
viêm đại tràng, táo bón.
Có thể thấy rằng, mặc dù đã có các chế phẩm chứa L. acidophilus nhưng
dạng bào chế còn hạn chế, chủ yếu là dạng thuốc bột, thuốc cốm pha hỗn dịch uống,
dạng bột đóng trong viên nang cứng. Nhược điểm của dạng bột thuốc chứa VSV là
VSV dễ bị các yếu tố bên ngoài môi trường tác động khiến suy giảm số lượng VSV
5


sống, hạn sử dụng ngắn. Hiện nay, phương pháp vi nang hóa probiotic đang được
nghiên cứu và phát triển nhằm nâng cao khả năng sống sót của VSV có trong sản
phẩm.
1.3. Tổng quan về vi nang hóa probiotic
1.3.1. Định nghĩa
Vi nang là các tiểu phân kết tụ hình cầu hoặc không xác định, thành phần
gồm dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao trong một màng polyme thiên
nhiên hoặc tổng hợp; có kích thước trong khoảng 1 - 5000 μm (trong thực tế thường
điều chế vi nang trong khoảng 100 - 2000 μm) [6], [8].
Phương pháp vi nang hóa có thể được định nghĩa là một quá trình bẫy một
chất (hoạt chất) trong một chất khác (vật liệu tường), tạo ra các hạt có đường kính

quan trọng. Ưu điểm của vi nang như là một tấm áo choàng giúp cách ly tế bào với
môi trường xung quanh, giúp bảo vệ vi sinh vật tránh khỏi các tác hại của nhiệt độ
cao, pH thấp, áp suất thẩm thấu cao và khả năng bị oxy hóa trong suốt quá trình chế
biến và bảo quản [46], [53]. Bên cạnh đó, sự sống sót của vi khuẩn cũng bị ảnh
hưởng bởi acid dịch vị và muối mật trong đường tiêu hóa khi chúng được đưa vào
trong cơ thể. Vi nang hóa là phương pháp giúp cải thiện khả năng sống sót của vi
sinh vật trong thời gian bảo quản cũng như bảo vệ chúng khỏi tác động của acid dạ
dày trong đường tiêu hóa [26]. Lớp vỏ vi nang như một lớp rào chắn hạn chế giải
phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại.
Lớp vỏ có thể thiết kế để bảo vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện khác
nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [49].
Với ưu điểm có thể bảo vệ được vi sinh vật và protein khỏi ảnh hưởng bởi
các tác nhân bên ngoài môi trường, acid dịch vị và muối mật, vi nang hóa được ứng
dụng nhiều trong việc bao gói vi sinh vật để tạo chế phẩm probiotic và cố định tế
bào, cố định enzym [23].
1.3.3. Các phương pháp vi nang hóa
Có rất nhiều phương pháp để đóng gói probiotic trong vi nang calci alginat
đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố. Việc lựa chọn phương pháp chế

7


tạo vi nang phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích thước
vi nang… [6].
Có thể phân loại các phương pháp vi nang hóa như sau:
-

Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp); các polyme không tương
thích; bốc hơi dung môi, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…




[16]. Hai acid này liên kết với nhau qua liên kết 1-4-glycosid, tùy từng nguồn gốc
alginat mà tỷ lệ có mặt hai loại acid này khác nhau. Các đơn vị monome liên kết với
nhau theo chuỗi, tạo thành các khối; các khối này có thể chỉ chứa đồng vị MM hoặc
GG và có thể gồm hỗn hợp các đơn vị M và G liên kết với nhau. Tập hợp các khối
này tạo nên cấu trúc của acid alginic và muối alginat [13].
Natri alginat được chiết xuất từ rong biển, với tính chất không độc, không
tương thích sinh học, giá thành rẻ, do đó được sử dụng rộng rãi, an toàn và là muối
alginat có tính thương mại nhất trong ngành thực phẩm [31], [49]. Khi tiếp xúc với
nước, natri alginat sẽ tạo thành dung dịch nhớt, được ứng dụng trong ngành dược
phẩm để làm chất mang các dạng thuốc giải phóng có kiểm soát [13]. Natri alginat
có thể chuyển từ trạng thái sol sang dạng hygrogel với hàm lượng nước lên đến
95%, có thể được sử dụng như một chất làm ổn định hệ gel [49].

Hình 1.2 Cấu trúc của alginat
1.3.5.2. Cấu trúc vi nang calci alginat
Khi có mặt của các ion hóa trị hai như Ca++, Ba++, Sr++, các khối GG có trong
thành phần của alginat có các vị trí tương thích giúp tạo liên kết ion với các ion hóa
trị hai này, tạo nên cấu trúc ‘hộp trứng’, hình thành cấu trúc một mạng gel ba chiều
và xảy ra hiện tượng đông rắn [16], [31], [49]. Quá trình gel hóa này giúp cho tế
bào được nhốt trong các mạng lưới alginat mà vẫn duy trì chức năng sinh học [31].
Khi tạo vi nang calci alginat bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, nhỏ dung dịch
natri alginat vào dung dịch Ca++, ban đầu calci alginat sẽ hình thành vào tạo nên sự
hóa rắn bề mặt. Tiếp theo, ion Ca++ sẽ thấm dần vào lớp alginat, tạo gel và cứng dần
[13]. Kích thước của vi nang thường phụ thuộc vào độ nhớt của dung dịch polyme,
9


đường kính kim nhỏ giọt và khoảng cách giữa kim nhỏ giọt và dung dịch đông tụ


-

Giai đoạn phản hấp phụ (làm khô thứ cấp): Sử dụng nhiệt độ cao hơn giai
đoạn thăng hoa (phải phù hợp với độ nhạy nhiệt của chế phẩm), sấy loại bỏ
nước liên kết [35].

1.4.2. Ưu nhược điểm của quá trình đông khô
Chế phẩm trong quá trình đông khô được sấy khô trong điều kiện nhiệt độ
thấp, giúp không bị ảnh hưởng bởi nhiệt và vẫn giữ được hương vị, màu sắc, cấu
trúc vốn có. Đối với chế phẩm probiotic, đông khô giúp giữ được đặc tính probiotic
của vi sinh vật và không làm biến tính protein. Đông khô còn là một kỹ thuật thích
hợp để giữ giống vi sinh vật, vì quá trình đông khô giúp tăng khả năng sống sót của
vi sinh vật trong quá trình bảo quản và vật liệu khô có thể bảo quản ở nhiệt độ môi
trường xung quanh, dễ vận chuyển [20], [36], [47].
Tuy nhiên, đông khô là một trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi
sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic. Đặc biệt, giai đoạn tiền
đông có thể gây những áp lực cơ học lớn đối với vi sinh vật do sự giãn nở thể tích.
Sự hình thành phân tử đá nội bào có thể là nguyên nhân gây phá vỡ màng tế bào
[35]. Phân tử đá được hình thành ở ngoài màng tế bào, dẫn đến việc làm tăng áp
suất thẩm thấu của tế bào, khiến tế bào vi khuẩn mất nước [46]. Quá trình sấy còn
làm cho thể chất của lipid và protein màng thay đổi, làm giảm khả năng sống của tế
bào. Có nghiên cứu chỉ ra rằng sự oxy hóa lipid của màng tế bào là nguyên nhân
gây chết vi sinh vật dựa trên việc thay đổi tỷ lệ acid béo no và không no trước và
sau quá trình đông khô [20], [36].
11


1.4.3. Các tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô
Do quá trình đông khô làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật nên người


-

Nhóm khác: mật ong, natri acetat…[47]

1.4.3.1. Glycerol
Glycerol hay còn gọi là glycerin, là một hợp chất rượu đa chức, gồm 3 nhóm
-OH gắn vào gốc hydrocarbon C3H5. Công thức hóa học là C3H5(OH)3. Danh pháp
theo IUPAC là propan-1,2,3-triol. Là chất lỏng sánh, trong suốt, không màu, không
mùi, vị nóng và ngọt, hút ẩm mạnh, thân nước, trộn lẫn được với nước và ethanol
96% [1]. Nhiệt độ nóng chảy là 17,8oC, bay hơi ở 290oC kèm phân hủy. Khối lượng
riêng 1,2636 g/cm3 ở 20oC [55]. Nhiệt độ đông đặc của dung dịch glycerol trong
nước ở nồng độ 10%, 15%, 20% (kl/kl) lần lượt là -1,6oC, -3,1 oC và -4,8 oC [41].

Hình 1.4 Công thức phân tử của glycerol.

12


Glycerol là tá dược được sử dụng trong nhiều công thức dược phẩm, bao
gồm cả thuốc uống, thuốc nhỏ mắt, các chế phẩm tại chỗ… Trong công thức thuốc
nhỏ mắt và mỹ phẩm, glycerol thường được dùng bởi tính chất giữ ẩm và làm mềm
của nó. Với tính chất thân nước và có 3 nhóm OH, glycerol hay được sử dụng làm
dung môi, đồng dung môi trong các dung dịch uống và cả trong kem và nhũ tương.
Glycerol còn được sử dụng làm chất hóa dẻo gelatin trong sản xuất viên nang mềm
gelatin [55].
Bên cạnh đó, glycerol còn là một tá dược bảo vệ vi sinh vật trong quá trình
đông khô. Cơ chế bảo vệ của glycerol là làm giảm liên kết của nước với các protein
trong màng vi sinh vật, giúp cho quá trình đông lạnh ít ảnh hưởng đến sự thay đổi
áp suất thẩm thấu giữa trong và ngoài màng tế bào, giúp tế bào không bị vỡ gây

độn giúp duy trì khả năng sống sót của vi khuẩn [37].
Tại Trường Đại học Dược Hà Nội, Nguyễn Mai Hương (2014) đã tiến hành
tạo vi nang calci alginat chứa L. acidophilus có bổ sung thêm tinh bột thu được kết
quả tinh bột giúp cải thiện thể chất và số lượng VSV sống sót có trong vi nang [4].
Bùi Thị Lệ Quyên (2015) bổ sung thêm tinh bột và sữa gầy vào công thức của vi
nang calci alginat giúp bảo vệ VSV tốt qua môi trường acid dạ dày [10]. Đàm
Thanh Xuân và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tạo vi nang calci alginat bằng phương
pháp đông tụ với sự bổ sung thêm chitosan, glycerol, tinh bột cho khả năng sống sót
của L. acidophilus trong môi trường dạ dày và trong thời gian bảo quản tốt hơn [11].

14


Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose


K2HPO4

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Tinh bột sắn

Việt Nam

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Thạch (Agar)

Việt Nam

Natri clorid

Trung Quốc

Glycerol


5g

MnSO4.4H2O

0,05 g

Triamoni citrat

2g

Nước máy vừa đủ
pH

 Môi trường MRS thạch (MT2):
MT2 = MT1 + thạch (20g thạch/1.000ml môi trường)

15

1.000 ml
6,8-7,0


2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
 Thiết bị:
Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy vô trùng


Cân phân tích

Đức (Satorious)

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Máy lắc (Votex)

Trung Quốc (IKA)

Camera + Kính lúp soi nổi + Máy tính

Nhật (Nikon)

Máy đo hoạt độ nước

Thụy Sỹ (Hygrolab)

Kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Mỹ (Jeol JSM-7600F)

 Dụng cụ: