BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
--------------------

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO
CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2009


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là hoàn toàn trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi
sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đều đã được cảm ơn. Các thông
tin, tài liệu trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Hoàng Tùng

i




DL - Phosphinotricine

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................................................................I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU.........................................................................................II
MỤC LỤC..............................................................................................................................................................III
STT............................................................................................................................................................................V
TÊN BẢNG..............................................................................................................................................................V
TRANG....................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.1.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA
MÔ CALLUS LILY IN VITRO...........................................................................................................................V
38...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.2.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH CEFOTACIME ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH
NĂNG TÁI SINH CALLUS LILY “SORBONE”.............................................................................................V
40...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.3.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................................V
42...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.4.................................................................................................................................................................V
ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS...........................................................................................V
43...............................................................................................................................................................................V
BẢNG 4.5.................................................................................................................................................................V

BẢNG 4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................................41
BẢNG 4.4. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................42
BẢNG 4.5. ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG THỨC LÂY NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................45
BẢNG 4.6. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TIỀN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................46
BẢNG 4.7. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐỒNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN
CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)..............................................49
BẢNG 4.8. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC VÉC TƠ CHUYỂN GEN NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN
GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU 8 TUẦN)....................................50
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................................................56
PHỤ LỤC................................................................................................................................................................60
THÀNH PHẦN NỒNG ĐỘ NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH MẸ...........................................................................60

iv


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

STT
Trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến tỷ lệ sống
38

và khả năng tái sinh của mô callus Lily in vitro
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime đến tỷ lệ


49

năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
tumefasciens
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các véc tơ chuyển gen nhiễm đến
khả

năng

chuyển

gen

Agrobacterium tumefasciens
v

của

vi

khuẩn

50


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng lily Sorbonne chuyển
gen...................................................................................................................54

vi


1


1.2. Mục đích- yêu cầu
1.2.1. Mục đích:

- Xác định các thông số kĩ thuật cho các bước trong qui trình chuyển
gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, làm cơ sở cho việc
tạo cây chuyển gen mang các đặc tính mong muốn.
1.2.2. Yêu cầu.

- Xác định được nồng độ Cefotacime chọn lọc
- Xác định được nồng độ PPT sử dụng để chọn lọc.
- Xác định được phương pháp lây nhiễm vi khuẩn và thời gian đồng
nuôi cấy thích hợp.
- Đánh giá sự biểu hiện của các gen sau chuyển nạp.
1.3

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng có thể chuyển được
gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đồng thời, các thông số kĩ thuật đã xác
định được sẽ làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác
vào cây hoa lily Sorbonne nói riêng và các cây hoa lily nói chung.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài làm tiền đề và thúc đẩy việc ứng dụng
một phương pháp mới là tạo giống cây trồng chuyển gen mang đặc tính mong

vào sự tái sinh của tế bào. Do vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trường
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng, mang tính
quyết định tới thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh đó,
vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên
3


cứu không kém phần quan trọng (Potrykus, 1991).[17]
James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith
and Peter Waterhouse, (2000)[18] nhận thấy: để có thể tạo được giống mới
nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải đảm bảo 04 yêu cầu sau:


Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh được cây đã chuyển gen;



Hệ thống vectơ thích hợp để có thể đưa các gen lạ vào bộ DNA;



Có các gen thích hợp đã được nhân dòng và đã xác định được các đặc tính;



Các phương pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm,

nhà kính và đồng ruộng.
2.1.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.1.2.1. Cơ sở khoa học về khả năngchuyển gen ở thực vật

không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại
trừ mô phân sinh (meristem).
2.1.2.2. Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen

Mục đích chính của chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào
genome của tế bào vật chủ có khả năng tái sinh cây và biểu hiện ổn định tính
trạng mới. Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh được thành
cây, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm
biến nạp chưa thành công.
Ở rất nhiều loài thực vật, điều khó khăn là phải xác định cho được kiểu
tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp. Hạt phấn hay tế bào
noãn sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn
toàn, thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn thường được coi là
nguyên liệu lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc biến nạp gen vào
hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này,
người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc biến nạp gen đối với

5


các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra
những cây khảm.
Từ nhiều thập kỷ qua người ta đã biết rằng, tính toàn thể của tế bào thực
vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát
sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay phôi
được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng
tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh
(không có tính khảm).
2.1.2.3. Các bước cơ bản của chuyển gen


mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme và
dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần
tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung
điện, ở đây tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể
làm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có
thể đi vào bên trong tế bào. Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme
phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo nên. Các tế
bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng
với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng
các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot
được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.
Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện,
hiện nay có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA
vào trong tế bào. Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ
người ta có thể đưa các phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta
muốn biến nạp. Phương pháp này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động
vật, nhưng sau này người ta đã sử dụng cho tế bào thực vật. Phương pháp thứ
7


hai là bắn vào tế bào các vi đạn (microprojectile), thường bằng vàng hoặc
wolfram, được bao bọc bởi DNA. Phương pháp này được gọi là phi sinh học
và được sử dụng thành công ở nhiều loại tế bào khác nhau.
Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường không phải là
tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được
tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm
như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn. Từ một tế bào
biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế

Kỹ thuật lai Northern (Northern blotting)
Lai Northern là phương pháp xác định kích thước và số lượng các phân
tử mARN trong ARN tổng số hoặc poly(A) +ARN. Để làm việc này, trước hết
ARN tách đoạn bằng điện di trên gel agarose biến tính sau đó được thấm
truyền lên màng cellulose, nitro-cellulose, lên kính hay lên màng nilon. Về
nguyên tắc, lai Northern cũng tương tự như lai Sounthern. Điều khác biệt là
trong lai Northern, ARN được thấm truyền và sau đó được lai với ADN hoặc
ARN đánh dấu còn ở lai SountherADN được thấ truyền sau đó được lai với
ADN đánh dấu. Kỹ thuật này nhằm đánh giá hoạt động sao chép của gen
chuyển khi được gắn vào genome của cây chủ.
Kỹ thuật lai Western (Western blotting)
Kỹ thuật lai Western là kỹ thuật lai protein-protein. Protein mẫu sau khi
được phân tách bằng điện di trên gel acrylamide sẽ được chuyển sang cố định
trên một chất giá thể cũng bằng điện di. Chất giá thể thường sử dụng là các
loại màng khác nhau như màng nitrocellulose, diazophenylythio (DPT),
diazobenzyloxymethyl (DBM), nilon... Protein đã cố định trên màng sẽ được
phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép. Kỹ thuật lai Western là bước quan
trọng nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển khi được đưa vào cây
ở mức độ protein và thể hiện tính trạng.
9


2.1.3 Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử
dụng vectơ Ti-plasmid, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa
gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng.
Chi Agrobacterium được chia làm một số loài dựa vào triệu chứng gây
bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter (loài
này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u
(crown gall) và bệnh rễ tơ (hairy root disease), A. rubi gây bệnh khối u trên

sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường.
Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên Ti-plasmid sẽ gắn vào nhiễm sắc
thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt
gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này làm nguồn cacbon cho các hoạt
động biến dưỡng (Zhu và ctv, 2000).[23]

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

11


Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc
vòng, kích thước 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích
thước 200-800 kbp (Gelvin, 2003)[19], phần lớn những gen có liên quan đến
sự hình thành khối u ở thực vật đều nằm trong plasmid này nên được gọi là
Ti-plasmid.
2.1.3.1. Ti-plasmid

Ti-plasmid là một phân tử DNA sợi đôi mạch vòng nằm tách biệt với nhiễm
sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc
xác định Ti-plasmid như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing
principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên
cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu
cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)[2].
Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-DNA - trình tự mã
hoá được chuyển vào trong cây, vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham
gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep - cần
cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển
tiếp hợp của Ti-plasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các

tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin. Trong khi đó
gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây
với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích. Gen tml có thể kích
thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác.
Một nhóm gen được chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh
dưỡng cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phát triển, đó là các opines.
Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc
với một đường (Dessaux và ctv, 1998)[11]. Các tế bào chuyển gen tổng hợp
và tiết ra một số lượng lớn các opines. Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang
kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần
cho việc phân giải các opines được tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001)
13


[24]. Dựa trên các kiểu opines được hình thành từ các khối u mà phân chia
nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline,
succinamopine và agropine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi
chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Chẳng hạn như, các
Ti-plasmid kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa
cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine
hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và
tất cả những opine này đều được tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv,
1998)[11]. Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc
glutamic axit với glucoz (mặc dù điều này chưa được chứng minh bằng thực
nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung
gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa
mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa
thành agropinic axit (Dessaux và ctv, 1998)[11]. Bởi vậy, các khối u được tạo
ra bởi Ti-plasmid kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc
nhóm mannityl opine.

Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn
(hình II.3) và đưa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã
hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA.
Protein virD2 là một endonucleaz, protein này có chức năng xúc tác cắt sợi TDNA ở vị trí 5’của bờ phải sau đó virD1 cắt rời sợi T-DNA tại vị trí đầu 3 ’ của
bờ trái tạo thành một sợi đơn. Ngoài chức năng cắt sợi T-DNA virD2 còn có
chức năng khác như bám dính vào đầu 5’ để tránh sự tác động của enzim
nucleaz và chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào thực vật vì trong virD2
còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu định vị trong nhân (nuclear locolization
signal). Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp TDNA đã được đề nghị: virD2 vừa làm nhiệm vụ của một enzim integraz vừa
làm nhiệm vụ của một enzim ligaz (Ziemienowicz, 2001)[24].
VirE2 là một protein nối kết vào sợi đơn T-DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA
15


khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998)
giống như virD2, virE2 cũng có chứa một tín hiệu định vị trong nhân. VirB có
chức năng hình thành một cái kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp
chuyển sợi đơn T-DNA vượt xuyên qua tế bào vi khuẩn đến vách, màng tế
bào thực vật và sau đó vượt qua các lỗ nhân để vào nhân tế bào. Hai sản phẩm
của gen vir cũng được cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là:
virC1 và virC2. virC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này
nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của
virD1/virD2 endonucleaz (Gelvin, 2003)[19]. Một số tác giả khác cho rằng
virC1 và virC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhưng khi vắng mặt hai
protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị
rằng chúng có chức năng trong việc tăng cường sản xuất sợi đơn T-DNA (Zhu
và ctv, 2000)[23]. Cùng với protein virD4, mười một protein virB, virE2 và
virF tham gia đưa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã
hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA
dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào

độ 18-200C (Gelvin, 2003).

Hình 2.3: Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA
Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA
sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình II.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn được
thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện.
Sau đó protein virD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA.
17


Ngoài virD1, virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào
quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2
được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã
hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế bào chất của tế bào
cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân
tế bào (Ziemienowicz, 2001).
Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây (hình
II.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp
T-DNA vào bộ gen của cây đã được đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu
3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào.
Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều được
enzyme nucleaz thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các đoạn
vi tương đồng (microhomology) trên DNA của cây và gắn vào. Sự gắn kết
này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’
nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA
của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn TDNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành.
Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt
động tổng
hợp