BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
=============***=============

PHẠM NHƢ TRỌNG

PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS
PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
=============***=============

PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS


Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iii


LỜI CÁM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại Khoa Vi sinh - Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia dưới sự hướng dẫn của PGS.TS
Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc
gia.
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản
thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, quan tâm từ thầy cô, đồng
nghiệp, gia đình, bạn bè.
Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà đã hướng
dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ Khoa Vi sinh, Viện
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tận tình giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Và cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi,
chia sẻ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015
Ngƣời viết báo cáo

Phạm Nhƣ Trọng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iv



v


2.3. Các phương pháp xác định sự có mặt của độc tố aflatoxin ........................ 11
2.3.1. Phương pháp hóa sinh .............................................................................. 11
2.3.2. Phương pháp vi sinh ................................................................................. 11
2.3.3. Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR ........................................................ 12
2.4. Tình hình nghiên cứu về độc tố aflatoxin trên lạc ...................................... 14
2.4.1. Ngoài nước .............................................................................................. 14
2.4.2. Trong nước ............................................................................................... 14
PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 16
3.1. Đối tượng..................................................................................................... 16
3.1.1. Chủng chuẩn nấm Aspergillus và mẫu lạc ............................................... 16
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 16
3.1.3. Các môi trường chính sử dụng trong quá trình nghiên cứu ..................... 16
3.1.4. Hóa chất.................................................................................................... 16
3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 17
3.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus ................... 17
3.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ... 19
3.2.3. Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS.................... 19
3.2.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ ... 23
PHẦN THỨ TƢ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................... 26
4.1. Kết quả phân lập nấm mốc A. flavus và A. parasiticus............................... 26
4.2. Kết quả định danh nấm mốc dựa vào hình thái và cấu tạo vi thể ............... 26
4.4. Kết quả giải trình tự gen ITS định danh nấm A. flavus, A. parasiticus ....... 31
4.4.1. Kết quả tách chiết ADN ........................................................................... 31
4.4.2. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu ................................... 32
4.4.3. Kết quả giải trình tự ................................................................................. 33
4.4.4. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét...................................................... 36

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Công thức cấu tạo chung của aflatoxin ................................................ 8
Hình 2.2. Trình tự đoạn ITS đinh
̣ danh nấ m....................................................... 12
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 29
Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MEA ....... 30
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS ........................................... 33
Hình 4.4. Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 ....................................................... 35
Hình 4.5. Trình tự ADN của nấm M45 .............................................................. 35
Hình 4.6. Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 .................................................... 37
Hình 4.7. Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45.............................................. 39

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ix


DANH MỤC VIẾT TẮT

ADN

: Axid Deoxyribo Nucleic

ARN

: Acid ribonucleic


: Thin Layer Chromatography

YEP

: Yeast Extract Peptone

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

x


PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm mốc là nguyên nhân hàng đầu gây nên sự giảm chất lượng và phá hủy
nông sản sau thu hoạch, hơn thế nữa nhiều chủng nấm còn sinh độc tố nấm
(mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người
khi không may ăn phải, phổ biến nhất là chi Aspergillus (A. flavus;

A.

parasiticus; …) có khả năng sinh độc tố aflatoxin, các chủng nấm thuộc chi này có
phổ hoạt động rất rộng vì vậy có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại nông sản như ngô,
lạc, bông, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt như lạc) rất thích hợp cho sự phát
triển của nấm Aspergillus cũng như sự hình thành độc tố aflatoxin, đây là một loại độc
tố không bị phân hủy trong điều kiện đun nấu thông thường, có khả năng gây ung thư
đối với người sử dụng lâu dài [4].
Cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Cây lạc chiếm
một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới không chỉ do được gieo trồng trên
diện tích lớn ở trên 100 nước, mà còn vì lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573
Kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người, do vậy hạt lạc được

vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS;
- Phân tích khả năng sinh độc tố afatoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ.

2


PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu chung về lạc
2.1.1. Cấu tạo của lạc
Lạc còn được gọi là đậu phộng hay đậu phụng (tên khoa học là
Arachis
hypogaea L), là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam
Mỹ. Nó là loài cây thân thảo hàng năm có thể cao từ 3-50 cm. Hoa dạng hoa đậu điển
hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển
thành một dạng quả đậu dài

3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu

xuống đất để phát triển.
Hạt lạc là loại thực phẩm rất giàu năng lượng vì có chứa nhiều lipid. Theo
bảng thành phần dinh dưỡng các chất trong thực phẩm, hạt lạc có chứa nước 7,5%;
protein 27,5%; chất béo 44,5%; glucid 15,5%; cellulose 2,5% và một lượng nhỏ
vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, Folat ), các axid amin và các nguyên tố vi lượng (
K, P, Mg , Mn, Fe, Na, Zn, Cu...). Trong thành phần chất đạm (protein) có một
globulin là arachin (60-70%) và một albumin là conarachin (25-40%) cả hai chất
này đều không tan trong nước. Cả arachin và conarachin đều cho các acid amin như
methionin, tryptophan và d-threonin. Thành phần chủ yếu trong nhân lạc là dầu lạc.
Nó gồm các glycerid của acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất nhiều tuỳ
theo loại lạc, acid oleic 51-79%; acid linoleic 7,4-26%, acid palmitic 8,5% acid
stearic 4,5- 6,2%, acid hexaconic 0,1-0,4% và 2 acid chỉ thấy trong dầu lạc là acid

thị trường tiêu thụ. Theo số liệu của FAO 1999, có 100 nước đang trồng và xuất khẩu
lạc. Ở Senegal, giá trị lạc chiếm 80% giá trị xuất khẩu, ở Nigieria chiếm 60% giá trị
xuất khẩu. Hiện nay có 4 nước xuất khẩu lạc chủ yếu, đó là: Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ
và Việt Nam. Các nước phải nhập khẩu lạc là Nhật Bản , Canada, Philipin, Đức… Ở
Việt Nam sản lượng lạc xuất khẩu dao động từ 100-130 nghìn tấn/ năm [21].
2.2. Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên lạc
2.2.1. Các loại nấm sinh aflatoxin trên lạc
Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trên sản phẩm nông sản (đặc biệt là lạc) thuộc
chi Aspergillus gồm A. flavus và A. parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc
gen và là hai loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất. Việc xác định các loài
sinh aflatoxin hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái và loại mycotoxin sản sinh ra hoặc
dựa vào trình tự ADN (Ito và cộng sự, 2000).
2.2.2. Đặc điểm hình thái
A. flavus và A. parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố
aflatoxin trong môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy.
2.2.2.1. Đặc điểm hình thái của A. flavus

4


A. flavus phân bố ở khắp nơi trên trái đất: Dưới đất, trên các nông sản thực phẩm đặc
biệt là trên lạc và sản phẩm từ lạc là nơi phát triển ưa thích của chúng.
Con đường xâm nhập của A. flavus là chúng xâm nhập qua các điểm tiếp hợp
nhờ những chỗ do côn trùng hủy hoại gây ra. Tuy nhiên ở cây lạc tươi
A. flavus
khó xâm nhập hơn vì vậy mà chúng xâm nhập khi củ lạc già, nhất là sau khi thu hoạch.
A. flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15- 30 % nước, tức là vào thời gian đầu của việc
làm khô [4].
A. flavus có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2 và axid cyclopyazonic
(CPA).


vàng

- Đôi khi hóa nâu khi già

- Không bao giờ hóa nâu khi

thể

già
Bông

- Lớn, cầu, tỏa tia, đôi khi

- Nhỏ, cầu hoặc tỏa tia

tạo cột không rõ
Vi thể

Bọng

- Cầu - gần cầu

- Hình gần cầu

Thể bình

- 1 hoặc 2 tầng

- 1 tầng

của chúng [4].
 Độ pH:
A. flavus và A. parasiticus có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng
(pH =2 - 8) tùy thuộc vào loài. Nhưng pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4,5 6,5 [4].
 Nguồn cơ chất:
A. flavus và A. parasiticus có các enzyme thủy phân tinh bột, nhưng nguồn
hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm này là
glucose và saccharose [2].
A. flavus và A. parasiticus đều có khả năng đồng hóa các loại muối amoni và
nitrat. Ngoài ra còn có khả năng sử dụng axid glutamic, prolin, trytophan, alanin,
asparagin, histidin, lysine, methionine. Để đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển, các vi
nấm đòi hỏi một lượng cần thiết các nguyên tố đa lượng (P, K,S, Mg, Ca…), các
nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…) và các muối MgSO4, KCl, FeSO4, KCl,
FeSO4... [2]

6


2.2.4. Điều kiện sinh độc tố
Khả năng sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Chủng nấm mốc, nhiệt độ và
thành phần môi trường.
Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố trên. Một số
chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên
môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng độc tính của chúng nếu cấy chuyền
liên tiếp trên môi trường thích hợp. Khi khối lượng hệ sợi nấm càng nhiều thì khả năng
sinh độc tố càng mạnh và ngược lại. Môi trường bổ sung cao nấm men, peptone hay là
acid amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH = 5- 5.4, nhiệt độ 25- 28Cº)
là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành aflatoxin [4].
Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng có tác dụng kích thích sự tạo thành các
aflatoxin. Tuy nhiên, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng nhiều. Người ta đã

Khối lượng phân

LD50 (µg/50g trọng

Màu huỳnh

phân tử

tử (g/mol)

lượng cơ thể vịt)

quang

18,2

Xanh da trời

AFB1

C17H12O6

312

AFB2

C17H14O6

314


16,6

Xanh tím

AFM2

C17H14O7

330

62,0

Xanh tím

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho
phép phát hiện các aflatoxin ở nồng độ thấp ( 0,5 ng hay thấp hơn trên một vết của sắc
ký bản mỏng). Từ đó, nó cung cấp một cơ sở lý thuyết cho phép phát hiện và định
lượng các aflatoxin bằng phương pháp hóa lý [4].
Các aflatoxin tan tốt trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform và
metanol, đặc biệt là trong dimetylsulfoxit. Aflatoxin tan trong nước dao động khoảng
từ 10-20mg/l [2].
Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao không bị phân hủy khi đun nóng thông
thường mà chỉ bị phân hủy khi hấp ở 120ºC trong 30 phút. Do đó nó vẫn tồn tại trong

9


lạc mà không có sự có mặt của nấm mốc. Tuy nhiên khi để trong không khí đặc biệt là
dưới tia tử ngoại aflatoxin tương đối không bền.
Các aflatoxin cũng có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng việc xử lý mạnh bằng

10


2.2.5. Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thể
Ở mức độ tế bào việc nhiễm aflatoxin vào cơ thể với liều lượng khác nhau sẽ gây
ức chế enzym ADN và ARN polymerase ở gan do các aflatoxin liên kết với nhân ADN
trong tế bào. Theo đó là sự giảm sút quá trình sinh tổng hợp protein, đặc biệt khi quá trình
chịu ảnh hưởng mạnh sự biến đổi ở quá trình sinh tổng hợp của mARN. Người ta chứng
minh rằng vòng α, β lactone không bão hòa trong phân tử aflatoxin làm cho chất này gây
ức chế tổng hợp ADN nhân tế bào. Do đó gây rối loạn quá trình quá trình tổng hợp tế bào
[2].
Aflatoxin gây tác động lên gan, thận, não, gây ung thư gan nguyên phát, trong
đó aflatoxin có độc tính gây ung thư mạnh nhất là AFB1. Ngoài ra, AFB1 cũng gây ra
sự khác thường ở nhiễm sắc thể như các đoạn nhiễm sắc thể có cầu nối ở đôi chỗ [4].
2.2.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin
Cho tới nay vai trò của aflatoxin sản sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát
triển của Aspergillus vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ, có nhiều sy đoán
được đưa ra (Benet và Christensen 1983; Ciegler 1983; Demain 2000).
Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là một quá trình phức tạp trải qua nhiều giai
đoạn và có sự tham gia của rất nhiều enzym và protein do tập hợp gen mã hóa. Các
gen này không nằm riêng lẻ mà tập hợp lại thành một cụm gen gồm 25 gen có kích
thước 66kb. Trung bình 1 gen có kích thước khoảng 2,8 kb, trong các gen này gen lớn
nhất có khối lượng khoảng 5-7 kb [20].
2.3. Các phƣơng pháp xác định sự có mặt của độc tố aflatoxin
2.3.1. Phương pháp hóa sinh
Cho tới nay việc sử dụng các phương pháp hóa sinh như phương pháp sắc ký
bản mỏng (TLC), phương pháp ELISA, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) là phổ biến nhất trong việc phân tích aflatoxin. Các phương pháp này có đặc
điểm là tương đối chính xác, tuy nhiên nhược điểm là không thích hợp cho số lượng
mẫu lớn do phải tách chiết trong hệ dung môi phức tạp, đồng thời tốn nhiều thời gian

Hình 2.2. Trình tự đoạn ITS định danh nấm
Đoạn ITS (Internal Transcribed spacer) hay vùng đệm được phiên mã bao gồm
2 vùng ITS1 và ITS2 nằm giữa 18s; 5,8s và 28s trong đoạn cấu trúc thành operon
rDNA. Trong sinh vật nhân chuẩn được lặp lại hàng nghìn lần. Trình tự ITS được sử
dụng rộng rãi trong định danh do chúng dễ dàng khuếch đại, có nhiều bản lặp và là
12


vùng không dịch mã nên có áp lực tiến hóa thấp sẽ tạo sự khác nhau đủ để phân biệt
các loài. Hơn thế nữa trình tự ITS của chi Aspergillus đã được giải trình tự khá đầy đủ
trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [13].
2.3.3.2. Cơ sở thiết kế mồi cho các phản ứng PCR
Trình tự mồi là chìa khóa của sự thành công hay thất bại của một phản ứng PCR.
Nếu mồi được thiết kế đúng chuẩn mực thì phản ứng sẽ cho kết quả tốt, mồi thiết kế
không chuẩn thì phản ứng sẽ thất bại. Tìm ra trình tự mồi thích hợp là một vấn đề, ngoài
việc chúng cần tương ứng với các trình tự được đặt đối đầu cho vùng nhân bản mong
muốn của phẩn tử khuôn, thì nó còn yêu cầu tính đặc hiệu cao. Độ dài đoạn DNA được
nhân bản không còn là 3kb và lý tưởng nên nhỏ hơn. Một vấn đề quan trọng mồi cần dài
bao nhiêu thì đủ, nếu mồi quá ngắn thì chúng có khả năng bắt cặp với đoạn không mong
muốn và cho nhiều sản phẩm phụ, nếu mồi quá dài sẽ ảnh hưởng tới tốc độ bắt cặp làm
giảm hiệu quả phản ứng.
Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tốc độ bắt cặp làm
giảm hiệu quả phản ứng. Nếu như nhiệt độ rất cao thì sẽ không có sự bắt cặp nào xảy
ra thay vào đó các đoạn mồi và khuôn tách nhau ra. Còn nếu nhiệt độ quá thấp thì các
thể lai không tương xứng sẽ rất không bền vững. Nhiệt độ gắn mồi lý tưởng cần phảo
đủ thấp để tạo điều kiện bắt cặp giữa mồi và khuôn, nhưng cũng đủ cao để các thể lai
khập khiễng hình thành. Nhiệt độ này có thể tính toán bằng cách xác định nhiệt độ
nóng chảy Tm. . Tm là nhiệt độ mà ở đó thể lai cặp base bổ trợ tách nhau ra, va một
nhiệt độ thấp hơn Tm 1-2 ºC là đủ thấp để cho phép thể lai khuôn- đoạn mồi bổ trợ xảy
ra, nhưng lại quá cao để hình thành một đoạn lai để cặp base khập khiễng bền vững.

- Chun và cộng sự (2007) ở Hàn Quốc, tìm thấy các mẫu hạt lạc đã bị ô nhiễm
aflatoxin (chiếm 10,6 % tỷ lệ) có hàm lượng trong khoảng 0,20-28,2 mg/kg [12].
- Ở Trung Quốc, Wang và Liu (2006) tìm thấy hàm lượng aflatoxin trong lạc
nhiễm với mức trung bình là 80,3 mg/kg và mức cao nhất là 437 mg/kg [15].
- Năm 2013, tổng cộng có 198 lạc và sản phẩm của lạc ở các thành phố lớn của
Punjab của Pakistan được phân tích độc tố aflatoxin bằng HPLC thì kết quả cho thấy
59% lạc nguyên vỏ, 55% lạc nguyên bóc vỏ, 61% lạc rang nguyên vỏ, 68% lạc rang
bóc vỏ, 50% bơ lạc, 42% bánh lạc và 20% lạc nimko đã được tìm thấy nhiễm
aflatoxin. Nồng độ trung bình trong vỏ lạc là (6,4 mg/kg), lạc nguyên bóc vỏ (9,6
mg/kg), lạc rang có và không có vỏ (10,4 và 12,3 mg/kg), bơ lạc (2,4 mg/kg), bánh lạc
(4,6 mg/kg) và lạc nimko (3,4 mg/kg) [15].
2.4.2. Trong nước
Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về aflatoxin trong thực phẩm và biện pháp
giảm nguy cơ ô nhiễm aflatoxin như:
- Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Giang, Phan Thị Kim và cộng sự Cục an toàn
vệ sinh thực phẩm (2001) cho thấy kết quả khảo sát ban đầu xác định 95,4% trong số
14


243 mẫu khảo sát ngô và lạc ban đầu bị nhiễm aflatoxin, trong đó có 23,64% vượt quá
giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Sau 6 tháng can thiệp bằng cách tách tạp chất, sấy và
bảo quản, kết quả cho thấy có sự cải thiện rõ rệt: 76,6% không phát hiện aflatoxin;
23% mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng nhỏ hơn mức quy định [1].
- Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố aflatoxin B1 trên
ngô và lạc khô bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH3 nồng độ 6% hoặc Ca(OH)2
có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin. Nhưng chi phí xử lý bằng hóa chất này có
giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho
ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam [1].
- Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giá
mối liên quan của nguy cơ nhiễm aflatoxin tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn (1)