BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE
NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
TRÊN HEO (PRRS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC
ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH
SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS)
Chuyên ngành

: Công Nghệ Sinh Học

Mã số


TS. NGUYỄN TẤT TOÀN
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

4. Phản biện 2:

PGS.TS TRẦN THỊ DÂN
Hội Thú y Việt Nam

5. Ủy viên:

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên Đặng Ngọc Thùy Dương sinh ngày 16 tháng 11 năm 1983 tại Tp.
Long Xuyên, tỉnh An Giang. Con ông Đặng Hoàng Hải và Bà Lê Thị Cam.
Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTH chuyên Thoại Ngọc Hầu,
tỉnh An Giang năm 2001.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ sinh học hệ chính quy tại Đại học
Nông Lâm Tp.HCM năm 2005.
Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Công nghệ sinh học tại Đại học
Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: độc thân.

thành luận văn.
* Các anh chị phòng huyết thanh, chi cục Thú Y Tp.HCM.
* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn,
Đặng Ngọc Thùy Dương

iv


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc
và thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được
tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm
Tp.HCM từ tháng 7/2008 – 8/2009. Đề tài được thực hiện với 3 nội dung nghiên
cứu nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS
vaccine nhược độc để phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh và nghiên cứu
sự đa dạng di truyền của PRRSV. Các kết quả thu được như sau:
Quy trình RT-PCR phát hiện các chủng virus PRRS khác nhau dựa vào
vùng ORF7 đã xác định được 12 mẫu dương tính với PRRSV trong tất cả 18 mẫu
khảo sát. Cặp primer P71/P72 tham khảo Murtaugh và Elam (1996) cho phép xác
định dương tính PRRSV với cả 2 genotype Bắc Mỹ và châu Âu trong điều kiện thí
nghiệm.
Phương pháp RT-PCR-RFLP dựa trên đoạn ORF5 đã được ứng dụng thành
công để chẩn đoán phân biệt 11 chủng virus PRRS thực địa và PRRS vaccine. Cả 4
loại enzyme MluI, HincII, SacII và HaeIII đều có thể sử dụng riêng lẻ để phân biệt
virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine thuộc genotype Bắc Mỹ. Phân tích
RFLP bằng phần mềm Chromas Pro cho thấy sự kết hợp các enzyme PstI, HaeII,
HincII hay ClaI, HaeII, HincII sẽ có thể giúp phân biệt virus PRRS vaccine với
virus PRRS thực địa thuộc genotype châu Âu dựa trên ORF5.

Using Chromas Pro for RFLP analysis, combining PstI, HaeII, HincII or ClaI,
HaeII, HincII could help to differentiate a PRRSV vaccine strain from EU isolated
strains.
Twelve isolates of PRRSV were studied and compared with several PRRSV
isolates from other countries. Phylogenetic analysis showed that all isolates of
PRRSV in this study belong to the NA genotype. Sequence analysis revealed that
these isolates shared a close relationship with high virulent of Chinese PRRSV in
2006 and 07QN isolated in Quang Nam, VietNam (98 – 98,7 %). However, these
twelve isolates shared only 85,9 – 86,7 % nucleotide sequence identities with that of
the MLV-Besta.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang Chuẩn Y ......................................................................................... i
LÝ LỊCH CÁ NHÂN .............................................................................. ii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................ iv
TÓM TẮT ............................................................................................... v
SUMMARY ........................................................................................... vi
MỤC LỤC ............................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................... xii

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ............................................................................ 23
3.1.1 Thời gian ....................................................................................................... 23
3.1.2 Địa điểm ........................................................................................................ 23
3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 23
3.3 Vật liệu và hóa chất ............................................................................................... 23
3.3.1 Nguồn mẫu .................................................................................................... 23
3.3.2 Hóa chất......................................................................................................... 25
3.3.2.1

Hóa chất để tách chiết RNA.................................................................. 25

3.3.2.2

Hóa chất trong phản ứng RT- PCR ....................................................... 25

3.3.2.3

Hóa chất điện di .................................................................................... 25

3.3.2.4

Hóa chất để tinh sạch sản phẩm RT-PCR ............................................. 25

3.3.2.5

Hóa chất dùng trong RFLP ................................................................... 25

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 26
3.4 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................... 26
3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR .................... 26

3.4.3.2

Phân tích trình tự nucleotide, thiết lập cây sinh dòng .......................... 31

Chương 4. Kết quả và thảo luận
4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR ......................... 33
4.2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP trên
đoạn ORF5 .......................................................................................................... 34
4.2.1 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype châu Âu ............................................ 34
4.2.2 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype Bắc Mỹ............................................. 36
4.2.3 Phân tích RFLP ............................................................................................. 36
4.2.3.1

Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype châu Âu ...... 37

4.2.3.2

Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype Bắc Mỹ ....... 42

4.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng ORF5 ............................................... 45
4.4 Giả thuyết nguồn gốc của các chủng PRRSV tại Tp.HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu
và Đồng Nai......................................................................................................... 51
Chương 5. Kết luận và đề nghị
5.1 Kết luận .............................................................................................................. 53
5.2 Đề nghị .................................................................................................... 53
Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 55
Phụ lục ............................................................................................................. 63

ix


SVN: Serum Virus Neutralization

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1 So sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus PRRS vaccine với
virus PRRS gốc và 16 chủng phân lập ............................................. 12
Bảng 3.1 Các chủng virus PRRS trong nghiên cứu ..................................... 24
Bảng 3.2 Primer sử dụng để khuếch đại vùng ORF5 ................................... 28
Bảng 3.3 Các chủng virus PRRS được giải trình tự ..................................... 31
Bảng 3.4 Các chủng virus PRRS tham khảo trên thế giới ........................... 32
Bảng 4.1 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro ................ 38
Bảng 4.2 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro ............ 40
Bảng 4.3 Mã hóa code các enzyme .............................................................. 41
Bảng 4.4 Tổng hợp kiểu RFLP của các chủng virus PRRS genotype châu Âu...... 41
Bảng 4.5 ORF5 RFLP code của các chủng PRRSV xác định được ............ 44

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các quốc gia khác nhau ..............6
Hình 2.2 Mô hình các protein cấu trúc PRRSV ..............................................7

nhiều lần bùng phát thành dịch, gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến ngành chăn
nuôi và đời sống của hàng ngàn hộ dân Việt Nam.
Để phòng bệnh, vaccine nhược độc đã được sử dụng. Đây là loại vaccine
sống nên khi vào cơ thể heo, virus được nhân lên và tồn tại trong nhiều tuần, thậm
chí trong vài tháng (Mengeling và ctv, 1996). Các kỹ thuật phát hiện virus hiện có ở
VN như ELISA hay RT-PCR vẫn chưa có khả năng phân biệt được virus PRRS trên
heo có nguồn gốc từ virus vaccine hay virus thực địa. Vì vậy, cần phải có một
phương pháp giúp xác định được virus trên heo có nguồn gốc từ loại virus nào để
kiểm soát dịch bệnh hữu hiệu hơn, từ đó nâng cao hiệu quả quản lý phòng dịch ở
cấp độ vĩ mô.
Nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc và thực địa
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được tiến hành nhằm
xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine
nhược độc để phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh PRRS. Hơn nữa nghiên

1


cứu cũng tìm hiểu sự biến đổi nếu có của các chủng virus PRRS trong mẫu khảo sát
qua việc phân tích sự phát sinh loài của các chủng PRRSV thực địa.
1.2.

Mục tiêu nghiên cứu

-

Xác định quy trình RT-PCR phát hiện các genotype virus PRRS khác nhau.

-


vào năm 1988 và được ghi nhận ở Đài Loan năm 1991. Như vậy, đến năm 1994, hội
chứng rối loạn sinh sản hô hấp đã chính thức xuất hiện ở 16 nước và rộng khắp ở cả
3 châu lục: châu Mỹ, châu Á, và châu Âu.
Tại châu Âu, vào năm 1991, tác nhân gây ra hội chứng PRRS đã lần đầu tiên
được phân lập trên đại thực bào bởi Wensvoort và cộng sự, và được gọi là virus
Lelystad (LV). Ngay sau đó, năm 1992 tại Mỹ, virus gây bệnh (ATCC VR-2332)
cũng đã được phân lập bởi Collins và cộng sự và được định danh là virus gây hội
chứng vô sinh và hô hấp trên heo (swine infertility and respiratory syndrome (SIRS)
virus). Đến tháng 9 – 2006, bệnh này đã xảy ra đại dịch ở Trung Quốc làm hàng
triệu heo bị mắc bệnh và trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của virus
thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây chết rất nhanh trên heo.
Từ khi xuất hiện, bệnh này đã được gọi nhiều tên khác nhau như: bệnh bí ẩn
trên heo, hội chứng vô sinh và hô hấp trên heo (SIRS), hội chứng sẩy thai dịch vùng

3


và hô hấp trên heo (PEARS), bệnh heo tai xanh. Tuy nhiên, đến năm 1992, tại hội
nghị quốc tế về bệnh này ở St. Paul, Minnessota, Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã
nhất trí sử dụng tên chung của bệnh này là “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở
heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS).
2.1.2 Đặc điểm bệnh
Đầu tiên, PRRS bùng nổ trên thế giới với mức tàn phá dữ dội như gây sẩy
thai hàng loạt ở heo nái hay triệu chứng hô hấp trên heo con. Heo ở mọi lứa tuổi
đều có thể mắc bệnh. Bệnh rõ hơn trên heo nái mang thai, nái nuôi con, heo con
theo mẹ và tăng trưởng khi bệnh xâm nhập vào đàn lần đầu tiên.
Heo có thể cảm nhiễm qua đường miệng, mũi, sinh dục hay thông qua tiêm
bắp, tiêm phúc mạc. Khả năng gây bệnh của virus này rất cao, thí nghiệm đã chứng
minh chỉ cần 10 virion là có thể gây nhiễm cho heo qua đường mũi hoặc tiêm bắp
(Straw và ctv, 1999).

virus thuộc họ này có những đặc điểm chung sau:
(1) Gây nhiễm dai dẳng, không có biểu hiện triệu chứng và thường gây chết
(Plagemann và Moenning, 1992).
(2) Có khả năng xâm nhiễm và nhân lên trong đại thực bào (Plagemann và
Moenning, 1992)
(3) Có khả năng biến đổi gen rất lớn (Chang và ctv, 2002).
Các chủng virus PRRS phân lập được cho thấy PRRSV có quan hệ gần về
mặt sinh học, cấu trúc, và về gen với LDV hơn là EAV (Meulenberg và ctv, 1993;
Meng và ctv, 1995). Những nghiên cứu về kháng thể đơn dòng và đa dòng đã chứng
minh được giữa virus PRRS ở Bắc Mỹ và châu Âu có sự khác nhau về kháng
nguyên (Drew và ctv, 1995; Magar và ctv, 1997) và thậm chí giữa những chủng
PRRSV Bắc Mỹ phân lập được cũng có sự khác nhau (Magar và ctv, 1995). Hơn
nữa, những nghiên cứu về trình tự cũng cho thấy những chủng phân lập ở Bắc Mỹ và
ở châu Âu đã chia làm 2 nhánh riêng biệt. Do đó, hiện nay PRRSV được chia làm 2
genotype:
¾ Genotype châu Âu (EU)
¾ Genotype Bắc Mỹ (NA)

5


Theo Mardassi và ctv (1994) và Meng và ctv (1995), sự tương đồng về trình
tự nucleotide giữa virus thuộc genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ chỉ khoảng
67 %.

Chủng Châu
Âu (PRRSV- EU)
Genotype
châu Âu


nướcgia
khác
nhau
(xây
dựng dựa trên vùng ORF5)
(dựa trên vùng ORF5)
(www.porcilis-prrs.com/images/virus-structure.jpg)

(www.porcillis-PRRS.com/images/virus-structure.jpg)

2.1.3.2 Kích thước và hình thái học
Virus PRRS là một RNA virus, có vỏ bọc với đường kính 50 – 65 nm, bề
mặt nhẵn, và lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm. Trong đại thực
bào của phổi heo, virus PRRS hình cầu, kích thước 45 – 65 nm, lõi capsid 30 – 35
nm và màng kép lipid trơn láng bao bọc bên ngoài.

6


RNA
Protein N (ORF7) – 15kDa
Protein E (ORF5) – 24 - 26kDa
Protein (ORF4) – 30 - 40kDa
Protein M (ORF6) – 18 - 19kDa
Vỏ lipid
Hình
2.2:Mô
Môhình
hìnhcác
cácprotein

protein 2b ở PRRSV và protein E ở EAV (Snijder và ctv, 1999; Wu và ctv, 2001).
Gen mã hóa RNA polymerase

Các gen cấu trúc

ORF 1a
ORF 1b

3’

Hình
2.3:Cấu
Cấutạo
tạobộ
bộgen
gencủa
củaPRRSV
PRRSV
Hình 2.3:
(www.porcilis-prr.com/pathohenesis-PRRS.asp)
(www.porcillis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)
(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)
Trong đó:
Nsp 1- 12
GP 2, GP3, GP4:
E (GP5)
:
M
:
N

khoảng 102 amino acid, hơn nữa, trình tự amino acid tương đồng giữa 2 genotype
này chỉ đạt khoảng 32 %.
2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc
Trong những năm gần đây, dòng virus PRRS của Trung Quốc đã được nhắc
đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết cao. Tuy nhiên, bệnh PRRS đã xuất hiện ở
Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to
lớn cho ngành công nghiệp chăn nuôi heo của quốc gia này (Chen và ctv, 2006).
PRRSV được các nhà khoa học Trung Quốc đưa vào nghiên cứu và phân lập
từ năm 1996. Đến năm 2001, trình tự bộ gen PRRSV đã được giải mã trọn vẹn và
công bố lần đầu tiên bởi Yang và ctv (2001). Nhiều công trình sau đó được thực
hiện nhằm nghiên cứu sự phân dòng và sự đa dạng địa lý của các genotype PRRSV
phân bố trên khắp Trung Quốc đại lục (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và
ctv, 2007; Tian và ctv, 2007). Kết quả của các nghiên cứu này đã cung cấp những
thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV Trung Quốc với các chủng
virus khác trên thế giới và thiết lập những giả thiết ban đầu cho sự tiến hóa của
PRRSV tạo ra các chủng virus độc lực cao như hiện nay.
Đặc điểm về bộ gen của hai chủng PRRSV Trung Quốc HB-1 và HB-2 bước
đầu được miêu tả và so sánh với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ và châu Âu
trong nghiên cứu của Gao và ctv vào năm 2004. Hai chủng HB-1 và HB-2 đều có
tỷ lệ tương đồng cao (89,4 – 89,6 %) với chủng virus PRRS đại diện cho genotype
Bắc Mỹ (VR-2332) và chủng Trung Quốc BJ-4 được nghiên cứu trước đó, trong khi
đó chỉ tương đồng khoảng 54,3 – 54,7 % với chủng virus PRRS đại diện cho

9


genotype châu Âu (Lelystad virus). Điều này đã chứng minh là hai chủng virus HB1 và HB-2 đều nằm trong nhóm genotype Bắc Mỹ. Ngoài ra nghiên cứu còn phát
hiện một vùng đột biến mất đoạn 12 aa ở nsp2 thuộc dòng HB-2 khi so sánh với các
chủng thuộc genotype Bắc Mỹ khác và khẳng định đây là một chủng virus PRRS
mới.

liên quan đến tạo nên dòng virus độc lực cao của các tác giả cho thấy chủng gây
bệnh tương đồng cao với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ ở vùng ORF5, nhưng
đặc biệt có sự xuất hiện hai đột biến trên nsp2 (vùng ORF1). Đột biến thứ nhất là
đột biến mất leucine ở aa 482 và đột biến thứ hai là mất đoạn liên tục 29 aa từ aa
534 – aa 562. Những đột biến này chỉ xuất hiện trên những dòng gây tỷ lệ chết cao
và chỉ xuất hiện sau đợt dịch 2006. Từ các kết quả này, Tian và cộng sự (2007) đã
xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực
cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ với vùng tiến hóa tiềm
năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1. Các tác giả cũng gợi ý một số nguyên nhân
tiến hóa là do các chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc
chịu ảnh hưởng về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ, ẩm độ cao vào mùa hè
hay sự nhiễm các vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng virus
độc lực.
2.1.3.6 Virus PRRS vaccine
Yang và ctv (1997) đã so sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus vaccine
nhược độc với virus gốc VR-2332 và 16 chủng thuộc genotype Bắc Mỹ phân lập
nhằm tìm ra điểm khác biệt mã hóa cho virus vaccine nhược độc. Kết quả so sánh
nucleotide từ đầu 3’ của vaccine nhược độc và virus gốc cho thấy virus vaccine
nhược độc có 98 base thay đổi: 94 base được thay thế, 3 base bị mất và 1 base được
thêm vào (15, 26, 17, 29, 9, 6 base thay đổi tương ứng với các vùng ORF2, ORF3,
ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7). Tuy nhiên, hầu hết những base thay đổi này đều là
những thay đổi lặn, nghĩa là những thay đổi này không làm thay đổi amino acid
tương ứng, ví dụ như với 15 base thay đổi ở ORF2 chỉ làm thay đổi 5 amino acid
hay 29 base ở ORF5 thay đổi 13 amino acid. Trong những amino acid thay đổi đó
có rất nhiều amino acid đã hiện diện trong những dòng virus PRRS thực địa hay
virus PRRS độc lực được phân lập từ Bắc Mỹ hay châu Âu, chỉ có 7 amino acid là
hoàn toàn của riêng virus PRRS vaccine.

11