BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

DƯƠNG MINH THẠNH

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ HOÁ HỌC TRONG
TẠO CHỒI THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII) IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….W U X….

DƯƠNG MINH THẠNH

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ HOÁ HỌC TRONG TẠO
CHỒI THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII) IN VITRO
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn khoa học:
TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Dương Minh Thạnh

iii


CẢM TẠ
Tác giả xin chân thành cảm ơn:
- Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
- Ban lãnh đạo Phân viện Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ
- Phòng Đào tạo sau Đại học trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
- Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng quý thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
- Chân thành cảm ơn TS Vương Đình Tuấn, Phó Phân Viện trưởng Phân viện
nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện giúp
đỡ kinh phí và trực tiếp hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu cũng như
hoàn thiện cuốn luận văn này
- Chân thành cảm ơn toàn thể ban Giám đốc, nhân viên Phân viện nghiên cứu
Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ đã tạo mọi phương tiện cho tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thành cuốn luận văn.
- Chân thành cảm ơn bạn Nguyễn Xuân Cường, Phân viện Khoa học Lâm
nghiệp Nam Bộ đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện cuốn
luận văn này.

iv



Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của NAA, IBA lên sự hình thành rễ in vitro
với 6 nồng độ. Kết quả thu được chồi in vitro cao từ 2 cm trở lên ra rễ tốt khi nuôi
cấy trên môi trường ½ TE, bổ sung IBA (5 mg/l), sucrose (20 g/l), than hoạt tính
(0,5 g/l)

vi


SUMMARY
The thesis “ Study of some chemical factors in in vitro shoots induction of
Pinus merkusi was carried out from August 2008 to February 2010 at the Forest
Science Sub – Institute of South Vietnam. Experiments was designed in Completely
Randomized Design with three replications. The research showed that:
Experiment 1: Effect of commercial javel on explants at 3 concentrations and 3
periods of time. Mature seeds from open-pollinated Pinus merkusii were treated
with javel at 60% commercial solution for 15 min gave the best result (98,33%) of
sterilization.
Experiment 2: Effect of culture media on in vitro of Pinus merkusii with 4
media MS, DCR, MLV, TE. Mature zygotic embryos of Pinus merkusi were
cultured as initial explant to investigate the process of direct organogenesis.
Adventitous buds were initiated on TE medium supplemented with 4 mg/l N6 –
benzyladenine (BA), buds induction Pinus merkusii seen profusedly on this
medium.
Experiment 3: Effect of glutamine on in vitro buds induction of Pinus
merkusii with 5 concentrations. Medium TE supplemented glutamine at 500 mg/l
was the most suitable organic factors for buds induction.
Experiment 4: Effect of BA on in vitro buds induction of Pinus merkusii with
6 concentrations. Medium supplemented BA (5 mg/l) was the most suitable for buds

1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu ...............................................................................................................2
1.3 Giới hạn .................................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN ..........................................................................................3
2.1 Giới thiệu về thông nhựa (Pinus merkusii) ...........................................................3
2.1.1 Phân loại .............................................................................................................3
2.1.2 Đặc điểm thực vật học........................................................................................3
2.1.3 Đặc điểm phân bố và đặc tính sinh thái của thông nhựa....................................5
2.1.3.1 Trên thế giới ....................................................................................................5
2.1.3.2 Ở Việt Nam .....................................................................................................5
2.2 Giá trị kinh tế cây thông nhựa ...............................................................................7
2.3. Tóm lược những kết quả nghiên cứu về nuôi cấy in vitro chi Pinus. ..................8
2.3.1 Trên thế giới .......................................................................................................8
2.3.2 Ở Việt Nam ......................................................................................................10
2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................11
2.4.1 Auxin ................................................................................................................11

ix


2.4.2 Cytokinin ..........................................................................................................11
2.4.3 Amino acids .....................................................................................................13
2.4.4 Than hoạt tính ..................................................................................................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................15
3.1 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................15
3.2 Thời gian và địa điểm..........................................................................................15
3.2.1 Thời gian ..........................................................................................................15
3.2.2 Địa điểm ...........................................................................................................16
3.3 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................16
3.3.1 Các thí nghiệm .................................................................................................16

Javel

Hypochlorite – Na

LV

Môi trường Litvay và ctv, 1985

MS

Môi trường Murashige và Skoog, 1962

NAA

α - naphthalene acetic acid

TE

môi trường Tang và ctv, 1998

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Danh mục các loài cây ưu tiên cho lấy lâm sản ngoài gỗ ......................... 8
Bảng 4.1: Ảnh hưởng nồng độ javel lên tỷ lệ mẫu sống và vô trùng của 6 dòng
thông nhựa sau 4 tuần nuôi cấy trong thời gian 10 phút ....................... 24
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng lên tỷ lệ mẫu sống và vô trùng 6
dòng thông nhựa sau 4 tuần nuôi cấy ở nồng độ javel 60% .................. 25
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng lên tỷ lệ tạo chồi của 6

Hình 4.3: Ảnh hưởng của BA lên tạo chồi thông nhựa............................................ 41
Hình 4.4: Phôi thông nhựa trưởng thành qua từng giai đoạn. ..................................... 41
Hình 4.5: Ảnh hưởng của NAA lên tạo chồi thông nhựa. ....................................... 45
Hình 4.6: Biểu đồ ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ thông nhựa dòng 54. ................ 48
Hình 4.7: Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến tạo rễ thông nhựa dòng 54 ................... 48
Hình 4.8: Ảnh hưởng của NAA lên tạo rễ thông nhựa dòng 54 . ............................ 49
Hình 4.9: Ảnh hưởng của IBA lên tạo rễ thông nhựa dòng 54 . .............................. 49

xiii


Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Đặt vấn đề
Thông nhựa (Pinus merkusii) là cây có giá trị công nghiệp toàn diện cả về hai
mặt gỗ và nhựa. Gỗ thông có vân đẹp, mùi thơm, sợi dài, có nhiều đặc tính cơ lý tốt,
tỷ trọng 0,55 - 0,9, gỗ bền, chống chịu được mối mọt (đặc điểm này hơn gỗ thông
ba lá). Cây có nhiều nhựa thì gỗ càng nặng và bền (Lâm Công Định, 1977)..
Bên cạnh đó nhựa thông là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Phytoxit của thông
nhựa tiêu diệt được một số loại vi trùng, làm trong sạch môi trường. Trong nhựa
thông có dầu terpentin và colophan là sản phẩm được dùng trong nhiều ngành công
nghiệp: xây dựng, sản xuất sơn, kỹ thuật điện, luyện kim, chất tẩy rửa…(Lâm Công
Định, 1977).
Tuy nhiên, hiện nay cây thông ở Việt Nam nói chung và cây thông nhựa nói
riêng đang bị sâu róm (Dendrolimus punctatus) phá hoại với mức độ ngày càng
nhiều (Bộ Tài nguyên môi trường, 2007). Vì thế một yêu cầu bức xúc của ngành
lâm nghiệp là tạo được giống thông nhựa có khả năng chống chịu cao với sâu hại
nói chung và sâu róm nói riêng. Các nhà chọn giống đang sử dụng kỹ thuật lai tạo,
chọn giống truyền thống để tạo giống thông mới, tuy nhiên cách này tốn nhiều thời
gian và công sức. Trong khi đó kỹ thuật vi nhân giống đã được nuôi cấy thành công

có tên khác là Pinus mekusiana E, Pinus sumatrana Junghuhn.). Ở Việt Nam, thông
nhựa được gọi là thông ta hoặc thông hai lá. Ở Indonesia có tên là tusam, uyam
(Aceh), son song bai (Thái Lan), Mindoro pine (Philippines), tenasserim pine
(English) (Hidayat và Hansen, 2002).
Theo hệ thống phân loại thực vật thì thông nhựa thuộc chi Pinus, họ Pinaceae,
bộ Pirales, phân lớp Pinidae, lớp Pinopsida, phân ngành Pinicae, ngành
Gymnospermae (Lâm Công Định, 1977; Nguyễn Hữu Tranh, 1995).
2.1.2 Đặc điểm thực vật học
Thông nhựa là cây gỗ lớn, cao trung bình 20 - 25 m, đường kính 60 - 70 cm có
khi tới 1 m, thân thẳng và tròn, gốc không có bạnh vè, vỏ dày màu nâu đỏ nhạt, nứt
dọc sâu, tán lá rộng hình tháp góc phân cành từ 25 - 80o, cành cứng và giòn, hai lá
kim mọc ra từ một bẹ, bẹ dài 1 - 1,5 cm, màu nâu nhạt (Lâm Công Định, 1977).
Thông nhựa là loài cây lưỡng tính, nón đực mọc ra ở các nách bẹ lá, có chiều
dài từ 2 - 3 cm, màu vàng nhạt khi chín có màu vàng đậm. Là cây thụ phấn nhờ gió
nên nón đực chủ yếu tập trung ở những cành nằm phía dưới tầng tán lá, còn nón cái
ngược lại chủ yếu ở phần trên tán lá. Nón cái được mọc ra ở các đầu cành, thường
có 2 - 4 nón, nón gồm nhiều vảy xếp hình xoắn ốc, bên trong vảy có chứa noãn.
Noãn cái chưa được thụ phấn có màu xanh nhạt, vảy giữa mở, nhưng sau khi được thụ
phấn thì vảy quả đóng lại và quả chuyển sang màu xanh đậm. Khi quả chín có màu
vàng xậm, chiều dài quả 10 - 12 cm, đường kính quả 3 - 4 cm. Hạt thông nhựa hình trái

3


xoan dài 3 - 4 cm và có cánh, cánh hạt dài 1 - 1,5 cm. Khi hạt chín vảy quả mở ra để
hạt bay ra theo gió. Thời gian để khi hạt chín đến bay ra khỏi quả thường không quá
một tháng. Chu kỳ sai quả của thông nhựa là 2 - 3 năm (Lâm Công Định, 1977).

Hình 2.1: Quả và hạt thông nhựa
(Nguồn: www.sith.itb.ac.id, 2008 và www.chm-thai.onep.go.th, 2009 )

sạn và cuội kết. Chúng có phạm vi phân bố rộng, nằm trong giới hạn 10 vĩ tuyến với
5 kinh tuyến, ở độ cao dưới 100 - 200 m đến gần 1000 m so với mặt nước biển,
nhưng lại không liên tục. Về độ cao chủ yếu trên 3 vành đai: dưới 100 - 200 m, 500
- 700 m, và 800 m đến dưới 1000 m. Về độ cách biển cũng được giới hạn từ chỗ sát
biển hoặc cách biển 5 - 10 km đến 100 - 120 km (Lâm Công Định, 1977; Nguyễn
Xuân Quát, 1993).
Khoảng 30 năm trở lại đây, thông nhựa được gây trồng trên phạm vi rộng ở
các tỉnh vùng trung du miền Bắc và khu IV cũ với diện tích trên 105.000 ha, nhiều
nơi trồng thành rừng. Sinh trưởng rừng thông nhựa rất khác nhau ở các vùng và có

5


ảnh hưởng khác nhau đến môi trường. Ở Việt Nam, thông nhựa có phân bố ở cả
miền Bắc và Nam từ Lâm Đồng tới Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Hà
Tĩnh, Nghệ An. Ở vùng Bắc Trung Bộ, thông nhựa được trồng chủ yếu. Diện tích
trồng rừng thông nhựa ở Bắc Trung Bộ và khoảng 90,863 ha, chiếm tới 39,7% diện
tích và trữ lượng bằng khoảng 46,1% trữ lượng thông nhựa trong cả nước (Nguyễn
Thanh Tùng, 2007).
Thông nhựa thích hợp ở những vùng có nhiệt độ trung bình năm 22 - 25oC ,
lượng mưa hằng năm 1800 - 2100 mm. Tuy nhiên xét về mối quan hệ nhiệt ẩm thì
thông nhựa ở nước ta tồn tại và phát triển trên hai vùng có chế độ mưa mùa khác
nhau. Vùng I có chế độ mưa tập trung vào vụ hè thu trùng với mùa nắng nóng, còn
mùa khô trùng với tháng đông lạnh (như Tây Nguyên). Vùng II có chế độ mưa tập
trung vào vùng đông trùng với mùa đông lạnh, còn mùa khô trùng với tháng hè
nóng (như Bắc Trung bộ). Do sự phân bố như vậy, giữa hai vùng có những điều
kiện sinh thái, địa lý khác nhau dẫn đến tạo nên hai loại thông nhựa, đó là thông
nhựa vùng cao và thông nhựa vùng thấp. Sự khác nhau không chỉ ở đặc điểm hình
thái mà cả về khả năng sinh trưởng (Nguyễn Xuân Quát, 1993; Nguyễn Thanh
Tùng, 2007).

nghiệp xây dựng, 17% cho chế biến các sản phẩm tẩy rửa và hoá chất thường dùng,
21% cho sản xuất hoá chất, 40% cho các dạng thương nghiệp bán lẻ, 5% cho yêu
cầu khác (Lê Đình Khả và ctv, 1995; Hà Huy Thịnh, 1999).
Mặc dầu trong những năm gần đây, sản xuất nhựa tổng hợp trên cơ sở công
nghiệp hoá dầu đã tăng lên đáng kể, cũng như đã xuất hiện nhiều dung môi rẻ tiền,

7


song colophan va dầu terpentin vẫn không mất ý nghĩa của nó (Lê Đình Khả và ctv,
1995). Vì vậy nhựa thông vẫn đang là mặt hàng xuất khẩu có giá trị.
Bảng 1.1: Danh mục các loài cây ưu tiên cho lấy lâm sản ngoài gỗ. (1) có thể dùng
làm cây trồng rừng phòng hộ.
TT

Tên Việt Nam

Tên khoa học

1

Bời lời nhớt (1)

(Litsea glutinosa (Lour.) C.B. Rob.)

2

Điều (1)

Anacardium occidentale L.


8

Luồng

Dendrocalanus membranceus Munro

(Nguồn: Chọn loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng tại Việt Nam,
2004).
2.3. Tóm lược những kết quả nghiên cứu về nuôi cấy in vitro chi Pinus.
2.3.1 Trên thế giới
Phương pháp nuôi cấy mô cây rừng có lợi thế hơn phương pháp nhân giống
truyền thống là tỷ lệ tăng trưởng của cây nhanh hơn, chất lượng gỗ cao hơn, khả
năng kháng sâu bệnh tốt hơn nhưng có hai khó khăn trong nuôi cấy in vitro ở chi
Pinus là quá trình tạo rễ và giúp cấy thích nghi với môi trường bên ngoài
(Mohammed và Vidaver, 1988).
Có nhiều yếu tố trong điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến tạo phôi như vật liệu
khởi đầu (kiểu gen, nguồn gốc, giai đoạn sinh lý của mẫu cấy), môi trường dinh
dưỡng (các chất khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, các tác nhân hỗ trợ), môi trường
bên ngoài (nhiệt độ, các thành phần ánh sáng, chai lọ), việc điều chỉnh thời gian và
cuối cùng là sự tương tác giữa các yếu tố này (McCown và Sellmer, 1987)

8


Nuôi cấy mô conifer được báo cáo đầu tiên bởi Sommer và ctv (1975). Một vài
loài trong chi Pinus (palustris, pinaster, radiata, strobus, sylvestris và teada) đã
được nuôi cấy in vitro thành công (Sommer và ctv, 1975; Aitken và ctv, 1981).
Trong nuôi cấy in vitro conifer, phôi soma, mô sẹo được hình thành từ phôi hợp tử
trưởng thành, cotyledon đã được báo cáo (Handley và ctv, 1995).

caribaea Morelet). Vô trùng mẫu nuôi cấy bằng hypochlorite natri 7% trong 10
phút. Nuôi cấy phát sinh chồi trên môi trường khoáng WPM có bổ sung BA (5
mg/l) và kinetin (0,5 mg/l). Nhân nhanh chồi trên môi trường WPM có bổ sung BA
(1 mg/l), kinetin (0,1 mg/l) và 10% nước dừa. Vươn chồi trên môi trường WPM có
bổ sung tyrosin (5 mg/l) và adenin (5 mg/l). Tạo rễ trên môi trường WPM có bổ
sung NAA (1 mg/l) và rhizopond (50 mg/l).
Nguyễn Sơn (2005) nhân giống thành công cây thông ba lá (Pinus khasya
Royle) bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng in vitro. Vô trùng mẫu nuôi cấy
bằng hypochlorite natri 10% trong thời gian 20 phút cho số mẫu sống vô trùng cao
nhất. Nuôi cấy phát sinh chồi: kết quả cho thấy sự kết hợp của môi trường khoáng
cơ bản WPM + BA (0,5 mg/l) + NAA (0,1 mg/l) + CW (10%) cho khả năng phát
sinh chồi cao. Nhân giống trên môi trường khoáng cơ bản WPM. Nồng độ BA (1
mg/l) cho hệ số nhân giống cao nhất (6,4). Chu kỳ nuôi cấy phát sinh chồi hiệu quả
nhất là sau 6 tuần nuôi cấy. Trên môi trường WPM có bổ sung rhizopond (50 mg/l),
rễ được hình thành sau 60 ngày nuôi cấy với 8 rễ/cây và chiều dài rễ là 11,1 mm.
Trần Văn Định (2005) đã bảo tồn nguồn gen cây thông đỏ (Taxus baccata var.
wallichiana Zucc) bằng kỹ thuật nuôi cây tái sinh chồi đỉnh in vitro. Môi trường
WPM có chứa 0,1 mg/l BA, 0,1 mg/l Ki và hỗn hợp chất chống hoá nâu môi trường
(than hoạt tính, PVP, bạc nitrat) thúc đẩy những mẫu thực sinh hình thành được một
chồi cao. Khi tăng nồng độ BA lên 5 mg/l, xuất hiện cụm chồi ở cả mẫu cây 12
tháng tuổi và mẫu cây 15 - 18 tháng tuổi. Khi thay đổi chế độ trao đổi khí (đậy bằng
nắp giấy) và kết hợp với cường độ ánh sáng thấp (22,8 µmol/m2/s) làm tăng khả
năng hình thành chồi mới. Những chồi mới cao 2 – 2,5 cm ra rễ rất tốt khi nuôi cấy
trên môi trường khoáng WPM có bổ sung 2,5 mg/l IBA.

10


Nguyễn Thị Hoàng Vân (2008) đã nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây thông nhựa
Pinus merkusii in vitro. Môi trường thích hợp cho tạo chồi thông nhựa là DCR.