BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
****************

HUỲNH THỊ THU HƯƠNG

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ DÒNG VI RÚT PRRS
TRÊN ĐÀN HEO TẠI MỘT ĐỊA PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
****************

HUỲNH THỊ THU HƯƠNG

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ DÒNG VI RÚT PRRS
TRÊN ĐÀN HEO TẠI MỘT ĐỊA PHƯƠNG

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS TRẦN THỊ DÂN



CẢM TẠ

Xin thành kính ghi ơn
PGS.TS. Trần Thị Dân và Th.S. Trần Thị Bích Liên đã hết lòng tận tình dìu dắt,
hướng dẫn và giúp tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Ban chủ nhiệm và thầy cô Khoa
Chăn nuôi – Thú y, Phòng Đào tạo sau đại học đã tận tâm dạy, truyền đạt kiến thức và
tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học.
Ban lãnh đạo Chi cục Thú y Thành phố và Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm và điều
trị đã tạo điều kiện để tôi theo học lớp đào tạo thạc sĩ thú y.
TS. Trần Văn Chính và PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã giúp đỡ trong thời
gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Các bạn đồng nghiệp tại Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm và điều trị, và đặc biệt là
các chị và bạn trong Bộ môn Siêu vi – huyết thanh đã hỗ trợ trong suốt quá trình học
tập.

ii


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Huỳnh Thị Thu Hương sinh ngày 28 tháng 1 năm 1973 tại Hà Nội.
Con Ông Huỳnh Thuần và Bà Nguyễn Thị Tỵ.
Tốt nghiệp tú tài tại trường phổ thông trung học Bùi Thị Xuân, TP. Hồ Chí
Minh năm 1991.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công Nghệ Sinh Học hệ mở rộng tại Đại học Mở
Bán Công, TP. Hồ Chí Minh năm 1996.

vi rút PRRS và dòng vi rút lưu hành bằng phương pháp ELISA; (2) khảo sát tỷ lệ
nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao bằng phương pháp RT-PCR, và so
sánh sự tương đồng giữa kết quả RT-PCR với tỷ số S/P trong phát hiện kháng thể; (3)
đánh giá sự thống nhất giữa các kết quả RT-PCR phát hiện vi rút trong huyết thanh và
trong máu.
Tỷ lệ heo và tỷ lệ trại có kháng thể kháng vi rút PRRS chiếm khá cao tại địa
phương khảo sát (56,52% và 63,56%). Dòng vi rút PRRS tại địa phương là dòng Bắc
Mỹ. Ở loại hình chăn nuôi công nghiệp, tỷ lệ heo có kháng thể biến động từ 58,55%
đến 66,85%, nhiều hơn có ý nghĩa thống kê so với hộ chăn nuôi (48,25%). Heo hậu bị
có tỷ lệ huyết thanh dương tính cao nhất (72,22%), tỷ lệ này ít nhất ở nái và heo 1 - 3
tháng (49,08% - 52,10%). Trong các heo có kháng thể kháng vi rút PRRS tỷ số S/P có
giá trị tập trung trong khoảng 0,4 - 1,99.
Khi xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR, tỷ lệ heo nhiễm vi rút PRRS
huyết là 19,89%, và vùng tập trung nhiều trại công nghiệp có tỷ lệ nhiễm vi rút huyết
cao nhất. Đồng thời, có sự hiện diện của vi rút PRRS chủng độc lực cao tại vùng này
của địa phương khảo sát. Trại công nghiệp nhỏ và hộ chăn nuôi có tỷ lệ nhiễm vi rút
PRRS huyết cao nhất. Heo 1 - 3 tháng tuổi nhiễm vi rút PRRS huyết (82,86%) nhiều
hơn so với các hạng heo thịt, nái, hậu bị (tỷ lệ nhiễm biến động từ 5,75% đến 23,53%).
Khả năng phát hiện vi rút PRRS trong máu bằng phương pháp RT-PCR cao khi huyết
thanh heo có tỷ số S/P ≥ 1 và thấp ở mức S/P < 1. Riêng heo 1 - 3 tháng tuổi khả năng
phát hiện vi rút PRRS trong máu vẫn cao khi S/P ≥ 0,4. Phát hiện vi rút huyết khi kết
quả ELISA âm tính (S/P
sensitive when extracting RNA from whole blood.

vii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

Trang

Trang tựa
Trang chuẩn y ........................................................................................................... i
Cảm tạ .....................................................................................................................ii
Lý lịch cá nhân ...................................................................................................... iii
Lời cam đoan .......................................................................................................... iv
Tóm tắt .................................................................................................................... v
Mục lục ................................................................................................................ viii
Danh mục bảng và biểu đồ ..................................................................................... xi
Danh mục các hình và sơ đồ .................................................................................xii
Danh mục các từ viết tắt ..................................................................................... xiii
1. MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..........................................................................................................1
1.2 Mục tiêu.............................................................................................................2
1.3 Yêu cầu ..............................................................................................................2
2. TỔNG QUAN.............................................................................................................3
2.1 Giới thiệu vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên heo..3
2.1.1 Hình thái và cấu trúc ......................................................................................3
2.1.2 Phân dòng của vi rút .......................................................................................4
2.1.3 Các protein cấu trúc .......................................................................................5
2.1.4 Tính chất kháng nguyên và tính sinh miễn dịch ............................................6

3.3.3 Kít, hóa chất ly trích RNA và RT-PCR .......................................................24
3.4 Phương thức thực hiện ....................................................................................26
3.4.1 Khảo sát tỷ lệ heo có kháng thể kháng vi rút PRRS và các dòng vi rút ......26
3.4.2 Xác định tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao trên heo. ...27
3.4.3 Đánh giá sự thống nhất giữa kết quả phát hiện vi rút PRRS bằng phương
pháp RT - PCR từ huyết thanh và từ máu. ............................................................28
3.5 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản .................................................................28
3.6 Phương pháp xét nghiệm.................................................................................29
3.6.1 ELISA phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS trong huyết thanh .............29
3.6.2 ELISA phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS dòng Châu Âu và dòng Bắc
Mỹ trong huyết thanh ............................................................................................31
3.6.3 Phương pháp RT-PCR phát hiện vi rút trong huyết thanh và máu ..............33
ix


3.7 Xử lý số liệu ....................................................................................................35
4. KẾT QUẢ và THẢO LUẬN ...................................................................................36
4.1 Phân bố heo có kháng thể kháng vi rút PRRS và xác định dòng vi rút bằng
phương pháp ELISA .............................................................................................36
4.1.1 Tỷ lệ heo có kháng thể kháng vi rút PRRS theo vùng chăn nuôi ...............38
4.1.2 Tỷ lệ heo có kháng thể kháng vi rút PRRS theo loại hình chăn nuôi ..........39
4.1.3 Phân bố mẫu có kháng thể kháng vi rút PRRS theo hạng heo .....................41
4.1.4 Phân bố các mức tỷ số S/P trên các hạng heo ..............................................43
4.2 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao ....................................45
4.2.1 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao theo vùng chăn nuôi
............................................................................................................................46
4.2.2 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao theo loại hình chăn
nuôi .....................................................................................................................48
4.2.3 Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết và chủng độc lực cao theo hạng heo .......50
4.2.4 Phân bố heo nhiễm vi rút PRRS ở các mức S/P của kháng thể ................51

Bảng 4.10: Tỷ lệ phát hiện heo nhiễm vi rút PRRS huyết bằng phương pháp PCR ở
các mức tỷ số S/P...........................................................................................................52
Bảng 4.11: Kết quả RT-PCR phát hiện vi rút PRRS trong máu và huyết thanh ..........53
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ heo và trại có kháng thể kháng vi rút PRRS theo vùng chăn nuôi .38
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ heo và trại có kháng thể kháng vi rút PRRS theo loại hình chăn
nuôi ................................................................................................................................39
Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ huyết thanh dương tính theo hạng heo............................................42
Biểu đồ 4.4: Phân bố các mức tỷ số S/P trên heo có kháng thể kháng vi rút PRRS ....44
Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ heo và trại nhiễm vi rút PRRS huyết theo vùng chăn nuôi.............47
Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ heo và trại nhiễm vi rút PRRS huyết theo loại hình chăn nuôi ......49
Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ nhiễm vi rút PRRS huyết theo hạng heo.........................................50
xi


DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 2.1: Hình thái vi rút PRRS .....................................................................................1
Hình 2.2: Cấu trúc bộ gen của vi rút PRRS ....................................................................4
Hình 2.3: Độ tương đồng của trình tự acid amin được mã hoá từ các khung đọc mở
ORF1 đến ORF7 của các dòng vi rút thuộc dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ ................5
Hình 2.4 : Heo con yếu và thai chết lưu do heo nái nhiễm ............................................9
Hình 2.5: Bệnh tích trên heo chết do vi rút PRRS chủng độc lực cao .........................11
Hình 2.6 : Thao tác trên máy PCR và hệ thống máy đọc gel trong phương pháp
RT-PCR phát hiện RNA vi rút PRRS ...........................................................................16
Hình 2.7 : Thao tác ELISA phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS ...........................18
Hình 3.1: Bộ kít HerdCheck* PRRS 2XR phát hiện kháng thể kháng thể PRRS, bộ kít
CEVTEST suis PRRS E/S phát hiện vi rút PRRS dòng Châu Âu, bộ kít CEVTEST
suis PRRS A/S phát hiện vi rút PRRS dòng Bắc Mỹ ....................................................24
Hình 3.2: QIAamp®RNA Blood Mini Kit và QIAamp®Viral RNA Mini Kit ly trích
máu và huyết thanh ........................................................................................................25


IFA

: Indirect flourescent antibody

IHC

: Immunohistochemistry staining

IPMA

: immunoperoxidase monolayer assay

IRPC

: Relative index x 100

NHC

: Normal host cell

NS

: Serum virus neutralization

NSP

: Nonstructural proteins

OD


S/P

: Sample/positive

TMB

: 3,3’,5,5’tetramethylbenzidine

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp lần đầu tiên được phát hiện tại Mỹ năm
1987, lan rộng sang các nước Châu Âu và hiện nay bệnh có mặt trên khắp thế giới.
Bệnh gây tình trạng ăn không ngon, thở khó, sốt, sảy thai, chậm động dục, tăng số heo
con chết khi sinh, heo con rối loạn hô hấp, chậm phát triển và tăng tỷ lệ heo cai sữa
chết (Zimmerman và ctv, 2006). Bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho nền chăn nuôi
heo trên thế giới.
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1997 trên đàn heo nhập từ
Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại
heo giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh
rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007). Kết quả nghiên cứu của
Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2007) tại 21 trại chăn nuôi heo ở miền Đông
Nam bộ cho thấy có sự hiện diện của cả hai dòng Châu Âu và Bắc Mỹ. Từ đầu năm
2006, tại Trung Quốc đã phát hiện nhiều heo bệnh, chết, nguyên nhân do
vi rút PRRS dòng Bắc Mỹ thể độc lực cao làm chết cả heo trưởng thành và có tỷ lệ
chết lên đến 20%; đầu năm 2007 đến nay bệnh đã xảy ra ở nước ta tại nhiều địa


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên heo
Bệnh PRRS là bệnh truyền nhiễm, do vi rút Arterivirus thuộc bộ Nidovirales,
họ Arteriviridae gây nên. Có 2 dòng vi rút PRRS nhưng có rất nhiều chủng, khả năng
biến dị cao và tính gây miễn dịch chéo không cao. Hạch lympho là nơi vi rút nhân lên,
gây hư hại hệ thống miễn dịch dẫn đến tình trạng nhiễm thứ cấp trầm trọng trên heo đã
nhiễm vi rút PRRS trước đó, và cũng nhờ đặc điểm này vi rút tồn tại trong đàn trong
thời gian dài. Triệu chứng trên thú mắc bệnh rất đa dạng nhưng biểu hiện rõ trên nái
với chứng sảy thai và chậm động dục, gây bệnh hô hấp trên heo con, tỷ lệ chết cao trên
heo cai sữa.
Bệnh lây lan mạnh và gây thiệt hại lớn về kinh tế. Theo quyết định số
1037/2007/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn, bệnh chứng rối loạn
sinh sản và hô hấp trên heo (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS)
là bệnh phải công bố dịch.
2.1.1 Hình thái và cấu trúc
Vi rút PRRS là một vi rút RNA sợi
dương có vỏ bọc, đường kính 50 – 60 nm, có
mặt vỏ tương đối phẳng, và chứa lõi
nucleocapsid hình khối có đường kính 25 –
35 nm (Zimmerman và cộng sự, 2006).

Hình 2.1: Hình thái vi rút PRRS

Bộ gen của vi rút PRRS có chiều

(http://www.pointernet.pds.hu/ujsagok/
agraragazat/2005-ev/06/kepek/62-1-N.jpg)



4


vi rút dòng Châu Mỹ có trình tự gen dài hơn các chủng thuộc dòng Châu Âu 102 acid
amin và chỉ có 32% acid amin tương đồng (Meulenberg, 2000).
Theo Kegong (2007), vi rút PRRS chủng độc lực cao là nguyên nhân gây dịch
PRRS không điển hình thuộc dòng Bắc Mỹ và có cấu trúc protein nsp2 mất 30 acid
amin không liên tục so với cấu trúc protein nsp2 dòng Bắc Mỹ.

Hình 2.3: Độ tương đồng của trình tự acid amin được mã hoá từ các khung đọc mở
ORF1 đến ORF7 của các dòng vi rút thuộc dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ
(Meulenberg, 2000)
2.1.3 Các protein cấu trúc
Vi rút PRRS có từ 5 đến 7 protein cấu trúc. Những protein cấu trúc chính gồm
GP5, M và N được mã hóa từ ORF5, ORF6, ORF7. Protein N có trọng khối phân tử
nhỏ (15 kDa) và là protein cơ bản nhất của vi rút, được phát hiện với lượng lớn trong
các tế bào bị nhiễm và chiếm khoảng 20 - 40% lượng protein có trong hạt vi rút.
Protein M (18 kDa) không liên kết với phân tử đường, là protein ổn định nhất
của vi rút PRRS. Protein này có cấu trúc nhọn, có thể đóng vai trò gắn kết và nảy chồi.
Protein M có rất nhiều trong lưới nội chất, hình thành các phân tử dị hợp liên kết với
glycoprotein GP5 (25 kDa) bằng cầu nối disulfide (disulfide-linked heterodimers).
Các phân tử dị hợp này không liên kết chặt chẽ trong hạt vi rút và được cho là protein
cần thiết cho sự gây nhiễm của vi rút.
Protein GP5 có đầu tận cùng là N, được cho là có liên quan đến sự nhận biết
điểm tiếp nhận. Trong ống nghiệm, vi rút PRRS kích hoạt quá trình chết theo chu kỳ
của đại thực bào và tế bào mầm, và protein GP5 được cho là đóng vai trò khởi động
5



trong thời gian dài nhưng ở mức độ thấp (Loemba và ctv, 1996). Kháng thể trung hòa
6


kháng lại các glycoprotein GP4, GP5 và protein matrix (M) (Ostrowski và cộng sự,
2002).
Theo báo cáo của AUSVETPLAN (2006), sự bảo hộ chéo giữa các serotype
của vi rút PRRS không cao.
Đáp ứng miễn dịch của heo với vi rút PRRS rất thay đổi tùy độc lực vi rút.
Theo Johnson và cộng sự (2004), trên heo con 2 – 3 tuần tuổi nhiễm các dòng vi rút
PRRS có độc lực cao và trung bình kháng thể được phát hiện sau 15 ngày; tuy nhiên
heo được gây nhiễm với các dòng vi rút nhược độc có thể phát hiện được kháng thể
sau 21 – 28 ngày hoặc có thể không phát hiện được kháng thể 42 ngày sau khi nhiễm.
2.2 Đặc điểm truyền lây và triệu chứng bệnh tích
Heo nhà và heo hoang dã là động vật cảm nhiễm tự nhiên của bệnh. Vịt trời
cũng là động vật cảm nhiễm của vi rút PRRS (Zimmerman và ctv, 2006).
2.2.1 Chất chứa vi rút
Vi rút PRRS phát triển chủ yếu trong tế bào chất của đại thực bào phế nang
phổi và các đại thực bào ở các mô khác. Vi rút có thể nhân bản trong tế bào mầm của
tinh hoàn, bao gồm tinh tử và tinh bào heo nhiễm bệnh (Meulenberg, 2000).
Có thể phân lập được vi rút trong hạch amidan của thú sau khi nhiễm vi rút 157
ngày (Wills và ctv, 1997a), bằng phương pháp PCR có thể phát hiện được vi rú sau
nhiễm 225 ngày trong hạch amidan và 251 ngày trong huyết thanh (Wills và ctv,
2003).
Vi rút hiện diện trong phổi và não từ 7 đến 57 ngày, trong tinh dịch vào ngày
92, trong máu vào ngày 210 (Benfield và ctv, 1999b; Shin và Molitor, 2002), trong
nước bọt đến 42 ngày (Wills và ctv, 1997b), trong phân đến 38 ngày (Yoon và ctv,
1993) và trong nước tiểu đến 28 ngày (Rossow và ctv, 1994), trong sữa 9 ngày sau
nhiễm (Wagstrom và ctv, 1998). Vi rút tồn tại trong mô cơ và xương của thú nhiễm
bệnh (Zimmerman và ctv, 2006).

Theo Zimmerman và cộng sự (2006), nếu trong đàn có sự hiện diện của vi rút
PRRS thì heo cai sữa có tỷ lệ nhiễm tăng nhanh. Nghiên cứu của Dee và cộng sự
(1994) trên 3 đàn heo cho thấy có đến 80 - 100% heo 8 – 9 tuần tuổi nhiễm vi rút
PRRS. Maes (1997) khảo sát 50 đàn heo xuất chuồng cho thấy tỷ lệ heo nhiễm lên đến
96% (trích dẫn Zimmerman và ctv, 2006). Tuy nhiên trong các đàn, tốc độ lây nhiễm
phụ thuộc vào các nhóm heo, chuồng nuôi. Houben và cộng sự (1995) nhận thấy một
số lứa heo nhiễm vi rút PRRS sớm, khoảng 6 - 8 tuần và ở một số lứa khác nhiễm trễ
hơn, 10 tới 12 tuần tuổi.

8


2.2.3 Triệu chứng
Các dòng vi rút độc lực thấp có thể gây nhiễm ở phạm vi vùng hay địa phương
và hoàn toàn không gây triệu chứng lâm sàng. Các dòng độc lực cao gây nhiễm với
triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng và tùy thuộc tình trạng miễn dịch của đàn.
Giai đoạn nhiễm cấp tính khoảng 2 tuần và giai đoạn sau đó kéo dài khoảng 1 4 tháng. Ở giai đoạn nhiễm, heo có triệu chứng chán ăn, ngủ lịm, có thể giảm bạch
cầu, sốt 39 – 41oC, thở gấp, thở khó, xung huyết da trong thời gian ngắn, các cực của
cơ thể có màu xanh tím xuất hiện ở mọi lứa tuổi heo.
Nái mang thai thường sảy thai ở thời kỳ cuối thai kỳ, gây bệnh tự miễn trên heo
con. Sau khi sảy thai, heo chậm động dục hay bị nâng. Nái nuôi con mất sữa và viêm
vú.
Trên heo đực giống gây giảm tính hăng, giảm phẩm chất tinh dịch. Tinh dịch có
chứa vi rút và lây truyền cho heo nái qua thụ tinh.

Hình 2.4 : Heo con yếu và thai chết lưu do heo nái nhiễm
vi rút PRRS trong thời gian mang thai
(http://www.respig.com/site-map.asp)
Tỷ lệ chết cao trên heo trước cai sữa (có thể đến 60%). Heo con bị sinh non
không linh hoạt, gầy ốm, chân bơi chèo, thở nhanh, thở khó, phù kết mạc, vòm trán

nhân. Tuyến giáp, vỏ bạch huyết của lách, nang bạch huyết của hạch amidan, mảng
peyer có thể bị hoại tử, tiêu dịch và tăng sản.
Tại tim, mạnh máu và cơ tim có thể bị viêm nhẹ hay vừa sau nhiễm 9 ngày.
Viêm chất trắng não hay viêm não, tiểu não vào 7 ngày sau nhiễm.
Đôi khi sau 14 -42 ngày nhiễm vi rút, thận có tình trạng tập trung tế bào lympho
trong quản cầu và tiểu quản ngoại biên. Viêm mạch máu từng đoạn nghiêm trọng nhất
tại bể và tủy thận. Biểu mô vùng mạch tổn thương bị sưng, chứa dịch có protein, hoại
tử dạng fibrin, tập trung bạch cầu và đại thực bào ở trong và xung quanh mạch máu.
Bệnh tích vi thể quan sát trên tử cung heo nái gồm cơ tử cung và nội mạc tử cung bị
10