BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
-----------------------------

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN
TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ
MAI MỰC ỐNG

Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số

: 62540105

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HÒA - 2017


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG
Trường Đại học Nha Trang
2. PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN
Trường Đại học Nha Trang

Phản biện 1:


(Loligo chenisis)”. International Journal of Biological Macromolecules 93 (2016) 442–
447.
3. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung
(2016). “High purity and high molecular weight β-chitin from squid pens (Loligo
chenisis)”. 11th Asia pacific chitin and chitosan & 5th Indian chitin and chitosan society
symposium, Kochi, Kerala, India, 28-30 September, 2016.
4. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Khong Trung
Thang, Nguyen Anh Tuan, Trang Si Trung (2017). “Hight molecular weight and high
degree of deacetylation of chitosan prepared from squid pens (Loligo chenisis)”.
Journal of Polymer Material, Vol. 34, No. 1, 103-114.
5. Hoang Ngoc Cuong, Huynh Thanh Tung, Nguyen Cong Minh, Nguyen van
Hoa, Pham Thi Dan Phuong, Trang Si Trung (2017). “Antibacterial activity of
chitosan from squid pen (Loligo chenisis) against Erwinia carotovora from soft rot
postharvest tomato fruit”. Journal of Polymer Material, Vol. 34, No. 1, 319-330.


ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án:

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia
sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan
từ mai mực ống.

Ngành:

Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số:

62540105

cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối
lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo
quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng
khuẩn của chitosan.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

NGHIÊN CỨU SINH


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Hiện nay Việt Nam là nước xuất khẩu thủy sản sang 156 thị trường trên thế giới với
tổng kim ngạch đạt 6 tỷ USD/năm đóng góp tích cực vào sự phát triển kinh tế cả nước. Tuy
nhiên thực trạng hiện tại đang diễn ra là một lượng rất lớn phế liệu thủy sản (phế liệu cá, tôm,
cua, ghẹ, mực,…) bị thải ra sau quá trình chế biến gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường
và cân bằng hệ sinh thái. Do đó việc xử lý kịp thời và hiệu quả lượng phế liệu này không
những góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh
và hiệu quả sử dụng tài nguyên thông qua việc thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học. Gần
đây nguồn phế liệu mai mực được giới khoa học quan tâm nghiên cứu vì đây là nguồn nguyên
liệu tốt để thu nhận -chitin và chitosan có độ tinh khiết cao và có thể ứng dụng trong các lĩnh
vực như y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm và bảo quản nông sản sau thu hoạch. Tuy nhiên
các thông tin công bố về điều kiện thu nhận và tính chất của β-chitin và chitosan từ mai mực
ống còn rất hạn chế, trong đó có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn của chúng. Ở Việt Nam
chưa có nghiên cứu chính thức nào về quy trình thu nhận, đánh giá các hoạt tính sinh học và
ứng dụng β-chitin và chitosan thu được từ β-chitin. Đây là một rào cản khi tiếp cận với nguồn
nguyên liệu mai mực ống.
Song song với sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến thủy sản, lĩnh vực xuất
khẩu nông nghiệp đang tích cực hội nhập, trong đó chỉ tính riêng kim ngạch xuất khẩu rau quả
2015 đạt 1,8 tỷ USD. Tuy nhiên tổn thất nông sản sau thu hoạch ở hiện nay nước ta là rất cao,
chiếm tới hơn 20% tổng sản lượng gây tổn thất lớn cho nền kinh tế. Trong đó, thối nhũn (soft

phế liệu mại mực Loligo sp.
2. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ
và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu
chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch -chitin trong quá trình
thu nhận.
3. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá
trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan có độ deacetyl trên 90% đạt tiêu chuẩn
thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl.
4. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua
sau thu hoạch. Sau đó, khảo sát đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm chitosan thu
được ở các khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp. ở điều kiện in vitro và
in vivo.
4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại: Xác định hàm lượng protein còn lại trên
chitin (hàm lượng protein < 3%) bằng phương pháp MicroBiuret được mô tả bởi Aye và
Stevens 2006; Xác định độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của chitin dựa vào đo độ hấp phụ
quang học sau khi thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein và cộng sự 2008; Phân tử lượng trung
bình (Mw) của chitin được xác định thông qua độ nhớt nội và tính theo công thức Mark–
Houwink theo Einbu và cộng sự 2007; Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) đo trên máy PANalytical,
X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia chiếu xạ CuKα (λ = 1,54Å) với hiệu điện thế 40kV và cường
độ 40mA, góc quét 4o < 2θ < 44o, bước quét 0,05o, tốc độ quét 1o/min, ở nhiệt độ 25oC; Phổ
hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo trên máy Nicolet iS10, Thermo Scientific, bước sóng từ 548–
4000cm-1; Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng dung
môi DCl và D2O; Kính hiển vi điện tử SEM được chụp trên máy Hitachi S-4800; Kính hiển
vi điện tử truyền qua TEM được chụp trên máy H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện
2


thế 100 kv; Độ hòa tan của chitosan: được phản ánh thông qua mức độ hòa tan của 1g mẫu
trong 100ml dung dịch acid acetic 1% theo thủ tục được Samar và cộng sự 2013 ; Xác định độ

chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận chitin (Hình 1.1).
Thành phần hóa học của nguồn nguyên liệu được xem là yếu tố quyết định đến việc
lựa chọn qui trình tách chiết và chất lượng của sản phẩm chitin thu được. So với các nguồn
phế liệu vỏ tôm, cua và ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lượng chitin cao hơn nhiều (khoảng 303


50%) trong khi đó hàm lượng khoáng lại rất thấp (dưới 2%). Hàm lượng lipid cũng rất thấp
hoặc không phát hiện. Do đó, khi tách chiết thu nhận chitin có thể bỏ qua quá trình khử
khoáng và khử lipid mà chỉ tập trung vào quá trình khử protein (Hình 1.2).
O

HOH 2C
H

H
HO

HO

NH

HH
O
Ester bond
H3C

O
H

C

NHH

H

OH

HO

H

Chitin

CH3

O
C

O

C

H
H

O

HO

O


C R
Fatty acid
O

Ester bond

Astaxanthin

N
Imine bond

R CH
C

O

NH
Protein

R CH
C

O
n

NH
R CH2

Hình 1.1. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa astaxanthin với
các phân tử khác trong phế liệu tôm (Armenta và Guerrero-Legarreta, 2009).


Cắt mạch chitosan
(H2O2, )

Thu các chitosan ứng dụng

Thu các chitosan ứng dụng

Hình 1.2. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác
nhau.
4


1.2. TỔNG QUAN VỀ -CHITIN VÀ CHITOSAN
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitin
Mạch phân tử chitin được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu
nối –1,4–glucosid. Công thức phân tử chung của chitin là (C8H13O5N)n. Đặc biệt, các liên
kết hydro nội phân tử xảy ra giữa các nhóm các nhóm hydroxyl và acetamide. Từ cấu trúc
phân tử có thể thấy chitin rất khó bị hòa tan trong các dung môi khác nhau. Dựa vào cấu trúc
hóa học, chitin có thể được chia thành ba dạng α-chitin, β-chitin và γ-chitin. Các dạng chitin
này cũng tồn tại trong tự nhiên trên các đối tượng khác nhau. Các cấu trúc khác nhau dẫn đến
tính chất cũng khác nhau. Cụ thể, α-chitin có độ rắn tinh thể (CrI) cao nhất, còn β-chitin thì có
độ rắn thấp nhất. Các nghiên cứu đã chứng minh độ rắn tinh thể của của α-chitin (85%) từ vỏ
tôm, cua và ghẹ cao hơn nhiều so với của β-chitin (72%) từ mai mực.
1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan
Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi mạch
chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vậy chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn vị
Glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin. Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông
thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic. Hằng số phân li
acid (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môi trường acid loãng

Hiện tại một số cơ chế đã được đề xuất để quan sát đặc tính kháng vi khuẩn của
chitosan và các dẫn xuất. Cơ chế được chấp nhận phổ biến nhất giải thích rằng vách tế bào vi
khuẩn tích điện âm dễ dàng phản ứng với phân tử chitosan tích điện dương, làm biến đổi tính
thấm tế bào, không cho cơ chất vào tế bào và làm cho các thành phần cấu tạo tế bào thoát ra
ngoài, cuối cùng dẫn đến cái chết của vi sinh vật, tác động kháng khuẩn thường diễn ra rất
nhanh (trong vài giờ). Thêm vào đó, chúng đều là các chất có khả năng phân giải sinh học và
không gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, cần chú ý là khả năng này bị hạn
chế do tính tan hạn chế của chitosan (không tan trong môi trường pH > 7,0). Bên cạnh đó, độ
nhớt cao của dung dịch chitosan cũng là một trở ngại, gây kết tụ protein ở điều kiện pH sinh
lý.
1.3. BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH DO VI KHUẨN
Bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại nông sản sau thu hoạch chủ yếu do vi khuẩn Erwinia
spp. gây ra. Chi Erwinia spp. thuộc họ Enterobacteria là dòng vi khuẩn kỵ khí tuỳ ý gây bệnh
thối nhũn (soft rot) trên nhiều loại cây trồng và rau, củ, quả như khoai tây, cà chua, cải bắp,
dứa, ớt, cà rốt, hành tây, súp lơ, hướng dương, cây xương rồng và trên thuốc lá. Như các chi
khác thuộc họ Enterobacteria, chi Erwinia spp. là dòng vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử,
hình que, có thể di chuyển bằng các tiêm mao và là dạng vi khuẩn gây bệnh cơ hội có phổ ký
chủ rất rộng và khả năng lây nhiễm rất mạnh khi ở môi trường cận nhiệt đới và ôn đới. Các
nghiên cứu cho thấy các chủng gây bệnh chủ yếu trong chi này là Erwinia carotovora ssp.
carotovora (Ecc), Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca) và Erwinia chrysanthemi (Ech).
Khả năng Erwinnia sp. phá hủy thành tế bào thực vật, làm vết bệnh lan rộng, mềm và
phân rã là do tác động của các enzyme ngoại bào như endo-β-1-4-arabinase và endo-β-1-4xylanases. Các enzyme khác bao gồm nhóm cellulase có pH tối ưu gần 7, phá hủy vách tế bào
thực vật endohydrolysis của liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong cellulose, lichenin và ngũ cốc.
Các enzyme pectinase như lyases pectate (Pel), lyases pectin (PNL), polygalacturonases
(Peh) và methylesterases pectin (PME).
Erwinia sp. là dòng vi khuẩn tuỳ ý yếm khí, có thể tồn tại ở các điều kiện môi trường
khác nhau. Chúng không có khả năng tạo bào tử để có thể tăng khả năng tồn tại khi gặp điều
kiện sống không thuận lợi. Tuy nhiên chúng thường tồn tại trong hạt giống, nguyên liệu nông
sản bị nhiễm bệnh, trong quá trình canh tác, lưu trữ bảo quản và trong đất nông nghiệp tự
nhiên. Vi khuẩn này cũng được tìm thấy trong rễ của một số loại cỏ dại, cây trồng và nước

phương pháp Folch; hàm lượng chitin bằng phương pháp Rao và cộng sự; hàm lượng protein
bằng phương pháp Biuret và MicroBiuret.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng
Xác định thành phần acid amin bằng phương pháp GC với một bộ kit (GC-EZ: FAAST)
để phân tích acid amin tự do theo chuẩn AOAC; thành phần khoáng bằng phương pháp quang
phổ hấp thu nguyên tử AAS theo chuẩn AOAC (2000).
2.2.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan

7


- Xác định hàm lượng protein còn lại (hàm lượng protein > 3%) bằng phương pháp Biuret;
hàm lượng protein còn lại trên chitin (hàm lượng protein < 3%) bằng phương pháp
MicroBiuret được mô tả bởi Aye và Stevens 2006; độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của
chitin dựa vào đo độ hấp phụ quang học sau khi thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein và cộng sự
2008; Phân tử lượng trung bình (Mw) của chitin được xác định thông qua độ nhớt nội và tính
theo công thức Mark–Houwink theo Einbu và cộng sự 2007.
Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) đo trên máy PANalytical, X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia
chiếu xạ CuKα (λ = 1,54A) với hiệu điện thế 40kV và cường độ 40mA, góc quét 4 < 2θ

CaCO3 trong mai mực Loligo sp. là rất thấp so với hàm lượng CaCO3 trong vỏ tôm Penaeus
aztecus (48,9%), tôm Penaeus durarum (42,2%), vỏ cua (66,5%). Điều này khẳng định quá
trình thu nhận -chitin từ mai mực Loligo sp. sẽ thuận lợn hơn và là cơ sở để xem xét bỏ qua
quá trình khử khoáng bằng acid HCl như trong quy trình thu nhận chitin thông thường hiện
nay từ vỏ tôm, cua, ghẹ. Ngoài ra, không phát hiện thấy thành phần các kim loại nặng như
Hg, Pb, As trong mai mực Loligo sp.
Điều đó khẳng định, mai mực là nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận sản phẩm -chitin
và chitosan có độ tinh khiết cao và có thể được sử dụng trong các lĩnh vực như y dược, y sinh
và thực phẩm.
3.1.3. Thành phần acid amin
Kết quả phân tích trong nguyên liệu mai mực Loligo sp., các thành phần Alanine,
Proline, Tyrosine và Histidine chiếm tỷ lệ lớn nhất (4,39-6,68 g/100g) trong khi các thành
phần khác như Leucine, Isoleucine, Serine, Proline, Methionine, Glutamic acid,
Phenylalanine có tỷ lệ thấp hơn (0,53-2,6 g/100g).
Như vậy, nguyên mai mực ống có chứa một hàm lượng acid amin thấp hơn nhiều so
với nguyên liệu tôm thẻ. Điều này, sẽ thuận lợi hơn cho quá trình loại bỏ các acid amin để thu
được chitin và chitosan tinh khiết hơn và có khả năng sử dụng các sản phẩm này cho nhiều
ứng dụng đòi hỏi chitin và chitosan có độ tinh khiết cao.
3.2. THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP.
3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp.
Để có cơ sở tiến hành các khảo sát chi tiết, chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ trong một
khoảng rộng ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thu nhận chitin từ mai mực ống. Kết quả
cho thấy quá trình khử protein thực hiện ở nhiệt độ 30oC đạt hiệu quả rất thấp. Kết quả khẳng
định để đạt được mục tiêu yêu cầu về hiệu quả của quá trình khử protein (hàm lượng protein
còn lại nhỏ hơn 1%), đồng thời giảm thời gian khử, giảm sự cắt mạch chitin và có thể được áp
9


dụng vào sản xuất ở qui mô lớn thì nên tiến hành các khảo sát chi tiết them trong khoảng ảnh
hưởng của nồng độ NaOH 3-6 %, nhiệt độ từ 70-90oC trong khoảng thời gian 4-14 giờ với tỷ lệ

mạch chitin trong quá trình khử. Kết quả này là do các mạch chitin liên kết rất chặt chẽ với
các thành phân protein, khoáng thông qua 4 nhóm liên kết chính: các liên kết cơ sở Schiff,
liên kết O-glycosidic, liên kết N-glycosidic (68-91%) và các liên kết cộng hóa trị rất khó bị
phân cắt. Trong môi trường NaOH, mai mực bắt đầu trương nở cấu trúc và tiếp xúc với
NaOH và cắt đứt các liên kết protein và phức protein chitin từ đó khử dần protein trong mai
mực. Tuy nhiên quá trình cần hỗ trợ của yếu tố nhiệt độ và thời gian để NaOH có thể thấm
sâu vào cấu trúc và khử hoàn toàn protein trong nguyên liệu. Mặt khác, quá trình thấm sâu
vào cấu trúc để khử protein đã là đứt các liên kết nội giữa các mạch chitin và làm giảm khối
lượng phân tử trung bình của chitin. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu là sản phẩm chitin thu
nhận có hàm lượng protein nhỏ hơn 1%, đồng thời hạn chế quá trình cắt mạch của sản phẩm
chitin, chúng tôi đề xuất điều kiện khử protein là nồng NaOH 4% ở nhiệt độ 80C trong thời
gian 10 giờ. Sản phẩm -chitin thu được có hàm lượng protein còn lại 0,63% với Mw là 8545
kDa.
3.2.5. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống
3.2.5.1. Thành phần và tính chất cơ bản của sản phẩm -chitin
Mai mực ống có màu hơi vàng và trong suốt thì sản phẩm -chitin ở dạng bột có màu
trắng sáng. Sản phẩm -chitin thu được có hàm ẩm dưới 10%, có hàm lượng kim loại nặng
không phát hiện, hàm lượng protein còn lại thấp hơn 0,63 %, khối lượng phân tử trung bình
cao (Mw = 8545 kDa) và có độ deacetyl (DD = 19,7%). Đáng chú ý, mặc dù không qua giai
đoạn khử khoáng bằng acid HCl và khử màu như các quy trình thu nhận chitin thông thường
nhưng sản phẩm -chitin vẫn đạt tiêu chuẩn thương mại với độ tinh khiết cao.
3.2.5.2. Cấu trúc bề mặt của mai mực và sản phẩm β-chitin
Quan sát bề mặt bề mặt cắt của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. (Hình 3.1a) thấy rõ
các tấm chitin được sắp xếp song song có định hướng và liên kết chặt chẽ các với các thành
phần khác như protein, lipid và khoáng tạo nên cấu trúc của mai mực. Sau quá trình khử, các
tấm chitin vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.1b).
11


Hình 3.2. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin.


3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN
3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng đến hiệu quả deacetyl -chitin
Tương tự như quá trình khử protein để thu nhận chitin từ mai mực. Trước khi tiến hành
quá trình deacetyl, chúng tôi cũng dựa trên các công bố trước đây và tính chất của sản phẩm
-chitin thu được trong nghiên cứu này để tiến hành khảo sát một khoảng rộng ảnh hưởng của
các thông số của quá trình deacetyl. Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ và nồng độ NaOH thì
quá trình deacetyl xảy ra nhanh và hiệu quả deacetyl tăng. Cụ thể, để đạt được chitosan có độ
deacetyl lớn hơn 90% thì nhiệt độ của quá trình phản ứng phải trên 60oC,nồng độ dung dịch
NaOH cần dùng phải trên 40%.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl β-chitin.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan
Khi tăng nhiệt độ từ 50 lên 90oC thì DD của sản phẩm chitosan tăng từ 60,2 lên 90,1%
trong khi MW lại giảm từ 7784 xuống còn 5604 kDa. Nhiệt độ khử càng tăng thì hiệu quả quá
trình deacetyl càng tăng, kết quả DD của sản phẩm chitosan đạt được là 87,9% khi khử ở
80C. Do đó, chúng tôi lưa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình deacetyl là 80C để làm các
khảo sát sau.
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch
chitosan
14


Kết quả cho thấy ở cùng điều kiện nhiệt độ 80C và thời gian khử 12 giờ, khi tăng
nồng độ NaOH thì hiệu quả quá trình deacetyl càng tăng (Hình 3.2). Giá trị độ deacetyl của
sản phẩm chitosan là 83,6% ở NaOH 50% và đạt 85,7% ở NaOH 55%. Do đó, để đạt được
mục tiêu nghiên cứu là thu được sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và hạn chế thấp nhất
quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình khử thì nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình
deacetyl là 50%.
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

phẩm chitosan thu được có DD = 91,3% và Mw = 6831 kDa.
3.3.6. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan
3.3.6.1. Hiệu suất thu nhận và tính chất cơ bản của chitosan
Kết quả cho thấy hàm lượng chitosan thu được từ mai mực ống cao hơn nhiều so với từ
vỏ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và vỏ tôm sú (Penaeus monodon). Như vậy,
mai mực ống là nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận chitin và chitosan.
So với sản phẩm chitosan thương mại (Sigma), chitosan từ mai mực ống sau khi thu
nhận có độ tinh khiết cao hơn do chứa hàm lượng khoáng và protein còn lại rất nhỏ (không
phát hiện). Sản phẩm -chitosan có màu trắng sáng với phân tử lượng trung bình Mw 6831
kDa và độ deacetyl DD 91,3 %. Độ tan của -chitosan là trên 99,7% trong dung dịch acid
acetic 1% và độ đục là 9,5 NTU. Đáng lưu ý, -chitosan thu được có khối lượng phân tử cao,
độ tinh khiết cao nên có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ cao như tạo màng
sinh học. Đồng thời -chitosan được dùng làm chitosan nền để cắt mạch tạo thành những
chitosan có phân tử khác nhau tùy theo mục đích sử dụng.
16


3.3.6.2. Thành phần khoáng và acid amine
Kết quả cho thấy hàm lượng acid amin còn lại trong chitosan là rất thấp. Sau quá trình
deacetyl, hầu hết các acid amin được loại bỏ khỏi β-chitosan trừ một lượng rất nhỏ còn lại của
histidine, alanine, valine và serine. Hàm lượng khoáng chứa trong β-chitin và chitosan là rất
nhỏ (không phát hiện), đặc biệt các kim loại nặng như As, Hg, Pb không phát hiện có trong
các mẫu β-chitin và chitosan (số liệu không được thể hiện). Như vậy, sản phẩm -chitin và
chitosan từ mai mực ống có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu cầu cho các nghiên cứu ứng dụng
trong các lĩnh vực thực phẩm và y sinh.
3.3.6.3. Cấu trúc bề mặt của chitin và chitosan
Sự khác nhau về tính chất bề mặt của mai mực, β-chitin và chitosan thể hiện trong Hình
3.5. Bề mặt cắt của mai mực có các tấm chitin được sắp xếp song song xen kẽ các với các
thành phần khác như protein, lipid và khoáng (Hình 3.5a). Sau quá trình khử thì các tấm
chitin vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.5b). Điều này có


Hình 3.11. Phổ H1-NMR của β-chitosan.
3.3.6.6. Độ phân tán polymer và phân tử lượng trung bình của chitosan
Để đánh giá khối lượng phân tử và sự phân tán khối lượng tử của sản phẩm chitosan,
chúng tôi tiến hành đo phổ đo tán xạ ánh sáng trung tâm (SEC-MALLS). Hình 3.9 trình bày
phổ SEC-MALLS của sản phẩm chitosan. Kết quả đo xác định kích thước của các hạt
chitosan trong dung dịch Mw = 6831 kDa.

Hình 3.12. Phổ SEC-MALLS của chitosan.
3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN
3.4.1. Phân lập, xác định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua
Tiến hành xử lý mẫu và phân lập trên môi trường PDA trong điều kiện pH trung tính ở
nhiệt độ từ 30C thu được 37 dòng khuẩn lạc đặc trưng. Khi nhuộm Gram 37 dòng vi khuẩn
đã phân lập đã chọn được 20 dòng vi khuẩn là gram âm có hình que, hai đầu hơi tròn, kích
19


thước của các tế bào vi khuẩn đều nằm trong khoảng (0,5-1,01,0-3,0m) và có khả năng di
động.
Từ 20 dòng vi khuẩn được chọn, sau khi đánh giá các đặt tính sinh hóa, sinh lý đã chọn
được 6 dòng nằm trong nghi ngờ là Erwinia sp.Từ 6 chủng phân lập được tiến hành chủng bệnh
nhân tạo trên 3 loại ký chủ: trái cà chua, khoai tây và bắp cải. Kết quả sau 72 giờ chủng vi khuẩn,
quan sát thấy có 4 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, vết bệnh đặt trưng trên cả 3 ký chủ.
Kết qủa phân tích trình tự gen 16S rRNA định danh 6 dòng vi khuẩn được chọn trình
bày trong Hình 3.13. Theo đó, chủng EC24-NT có kết quả phù hợp 97% sự tương đồng trong trình
tự của đoạn gen của chủng CP002038 Dickeya dadantii 3937 hay còn gọi là Erwinia sp. Kết quả
này được thu nhận từ thông tin trên ngân hàng gen của NCBI thông qua chương trình BLAST
SEARCH (Hình 3.14). Ngoài ra, dòng vi khuẩn sau khi được định danh được chụp trên kính hiển
vi điện tử SEM cho kết quả hình que, hai đầu hơi tròn, kích thước của các tế bào vi khuẩn đều
nằm trong khoảng (0,5-1,01,0-3,0m).

60 phút và các tế bào trở nên mờ trong dung dịch chitosan sau 30 phút.

Hình 3.16. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. được xử lý trong dung dịch β-chitosan
1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia sp. (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau
30 phút; (d) và kết quả sau 60 phút.
21