Header Page 1 of 27.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

Footer Page 1 of 27.


Header Page 2 of 27.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO


Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu
viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,
Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và làm việc tại Trung tâm.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích
lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015
Học viên

Đặng Thị Kim Anh

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 3 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 4 of 27.

Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 21
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ............... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ...................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2.1. Phân loại enzyme phytase ...........................Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Nguồn phytase............................................Error! Bookmark not defined.
1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE .......................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.



Header Page 5 of 27.

Luận văn thạc sĩ

2.2.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt .....Error!
Bookmark not defined.
2.2.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid
Miniprep ....................................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến
nạp xung điện ............................................................Error! Bookmark not defined.
2.2.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastorisError! Bookmark not defined.
2.2.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris .. Error! Bookmark
not defined.
2.2.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE.Error! Bookmark not defined.
2.2.10. Xác định hoạt tính phytase .......................Error! Bookmark not defined.
2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 ..Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước .....Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬNERROR!
DEFINED.

BOOKMARK

NOT

3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE .. ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.


not defined.
3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp ....... Error! Bookmark not
defined.
3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở
nhiệt độ cao ...............................................................Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ............................................ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
KIẾN NGHỊ ........................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 22
PHỤ LỤC ............................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 6 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 7 of 27.

Luận văn thạc sĩ
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOX1

Alcohol Oxidase 1

APS

Ammonium Persulfate

BMGY


IU

International Unit

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani medium
Northern Regional Research Laboratory

NRRL

(hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)
(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction


Tetramethylethylenediamine

YPD

Yeast Extract-Peptone-Dextrose

YPDS

Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 7 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 8 of 27.

Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 19
Bảng 2.2. Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa
phyA ......................................................................................................................... 20
Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein ....................................................... 27
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm........................ 28
Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi
đĩa 24 giếng .............................................................................................................. 41
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân
hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa ....................................................... 42

Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi
tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 ..................................................... 36
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và
vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 .... 37
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 39
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5
vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện ................................ 39
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyAStop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 ........................................ 40
Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% ............. 43
Hình 3.12. Xác định pH tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin ....
.................................................................................................................................. 45
Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin
.................................................................................................................................. 46
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 9 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 10 of 27.

Luận văn thạc sĩ

Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 47
Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit
amin .......................................................................................................................... 48

K21-Sinh học thực nghiệm

Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ
nấm mốc Aspergillus niger. Phytase từ A. niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở
pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với
phytate cao, và bền với tác động của pepsin. Phytase từ A. niger có nhƣợc điểm là
kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt
tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.
Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc
cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của
phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu
trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Phytase
của A. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả
năng hồi tính. Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn
hồi” nhiệt của enzyme.
Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt
Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase,
đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 11 of 27.

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 12 of 27.

Luận văn thạc sĩ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

22

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 13 of 27.

Luận văn thạc sĩ
interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”,
Aquacult. Res., 2005, 36, pp. 803–812.

10. Baruah K., Sahu N. P., Pal A. K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude
protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton),
juveniles”, J. W. Aquacult. Soc., 38, pp. 238–249.
11. Billington D. C., (1993), “The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and
Biological Significance”, Verlag. Chemie. Weinheim., 26, pp. 38-42.
12. Cheng C., Lim B. L., Turner B. L., Richardson A. E., Mullaney E. J., (2005),
“Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a
novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1. In Inositol Phosphates in the
Soil-Plant-Animal

System:

Linking

Agriculture

and


Luận văn thạc sĩ

19. Debnath D., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and
nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”,
Aquacult. Res., 36, pp. 180–187.
20. Deshpande S. S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations,
and their interactions on alpha-amylase activity”, J. F. Sci., 49, pp. 516-524.
21. Ellestad L. E., Angel R., Soares J. H., (2002), “Intestinal phytase II: A
comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species
with differing digestive strategies”, Fish. Physiol. Biochem., 26, pp. 259–273.
22. Findenegg G. R., Nelemans J. A., (1993), “The effect of phytase on the
vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”,
Plant Soil, 154, pp. 189-196.
23. Forsberg C. W., Phillips J. P., Golovan S. P., Fan M. Z., Meidinger R. G.,
Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R. R., (2003), “The enviropig physiology,
performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated
environment: the leading edge of change in the pork industry”, J. Anim. Sci.,
81, pp. 68–77.
24. Freund W. D., Mayr G. W., Tietz C., Schultz J. E., (1992), “Metabolism of
inositol phosphates in the protozoan Paramecium”, Eur. J. Biochem., 207, pp.
359-367.
25. Greaves M. P., Anderson G., Webley D. M., (1967), “The hydrolysis of inositol
phosphates by Aerobacter aerogenes”, Biochem. Biophys. Acta., 132, pp. 412418.
26. Greiner R. and Konietzny U., (1996), “Construction of bioreactor to produce
special breakdown products of phytate”, J. Biotechnol., 1996, 48, pp. 153-159.
27. Hartig, T., (1885), “Uber das Klebermehl”, Bot. Z., 13, 881–882
28. Hartig T., Weitere M., (1856), “das Klebermehl (Aleuron) betreffend”, Bot. Z.,
14, 257 –269


35. Laboure A. M., Gagnon J., Lescure A. M., (1993), “Purification and
characterization

of

a

phytase

(myo-inositol

hexakisphosphate

phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during
germination”, Biochem. J., 295, pp. 413-419.
36. Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression,
and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J. Mol.
Microbiol. Biotechnol., 23, pp.193-202.
37. Liu B. L., Rafiq A., Tzeng Y. M. and Rob A., (1998), “The induction and
characterization of phytase and beyond”. Enzyme Microbiol. Technol., 22, pp.
415-424.

K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 15 of 27.

25

Đặng Thị Kim Anh



“myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”,

Phytochemistry, 64, 1033–1043
46. Rao D. E., Rao K. V., Reddy T. P., Reddy V. D., (2009), “Molecular
characterization, physicochemical properties, known and potential applications
of phytases: An overview”, Crit. Rev. Biotechnol., 29(2), pp. 182-98.
47. Reddy N. R., Pierson M. D., Sathe S. K., Salunkhe D. K., (1989), “Phytates are
cereals and legumes”, CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla, pp. 218-227.
48. Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial
phytase on zinc availability”, Z. Ernahrungswiss, 31, pp. 269-277.
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 16 of 27.

26

Đặng Thị Kim Anh


Header Page 17 of 27.

Luận văn thạc sĩ

49. Sajjadi M., Carter C. G., (2004), “Effect of phytic acid and phytase on feed
intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon (Salmo
salar, L)”, Aquacult. Nutr., 10, pp. 135–142.
50. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T., (1989), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, pp. 123-128.
51. Sandberg A. S., Hulthen L. R., and Turk M., (1996), “Dietary Aspergillus
niger phytase increases iron absorption in humans”, J. Nutr., 126, pp. 476-480.


Luận văn thạc sĩ

61. Ullah A. H., Sethumadhavan K., Mullaney E. J., Ziegelhoffer T., AustinPhillips S., (2003), “Fungal phyA gene expressed in potato leaves produces
active and stable phytase”, Biochem. Biophy. Res. Co., 306(2), pp. 603-609.
62. Van Weerd J. H., Khalaf K. H. A., Aartsen F. J., Tussen P. A. T., (1999),
“Balance trials withAfrican catfish Clarias gariepinus fed phytase-treated
soybean mealbased diets”, Aquacult. Nutr., 5, pp. 135–142.
63. Viveros A., Centeno C., Brenes A., Canales R., Lozano A., (2000) “Phytase
and acid phosphatase activities in plant feedstuffs”, J. Agr. F. Chem., 48, pp.
4009–4013.
64. Vohra A., Satyanarayana T., (2001), “Phytase production by the yeast, Pichia
anomala”, Biotechnol. Lett., 23, pp. 551–554.
65. Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., Jandera A., (1994), “Phytase from
Aspergillus niger”, Folia Microbiol, 39, pp. 481-484.
66. Winterstein, E., (1897), “Uber einen phosphorhaltigen Pflanzenbestandteil,
welcher bei der Spaltung Inosit liefert”, Berichte. Deutsch. Chem. Ges., 30,
pp. 2299 –2302
67. Xiang T., Liu Q., Deacon A. M., Koshy M., Kriksunov I. A., Lei G. X., Hao
Q., Thiel D J., (2004), “Crystal structure of a heat-resilient phytase from
Aspergillus fumigatus, carrying a phosphorylated histidine”, J. Mol. Biol., 339,
pp.437-445.
68. Xiong A. S., Yao Q. H., Peng R. H., Han P. L., Li X., Fan H. Q., Guo M. J.,
Zhang S. L., (2004), “Isolation, characterization, and molecular cloning of the
cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high
expression in Pichia pastoris”, J. Biochem. Mol. Biol., 37(3), pp. 282-291.
69. Yan L., Li C., Chen H., Wu Q., Shan Z., Han X., (2013), “Site-directed
mutagenesis improves the thermostability and catalytic efficiency of
Aspergillus niger N25 phytase mutated by I44E, T252R”, Appl. Biochem.
Biotechnol., pp. 25- 37.

4894: gene cloning and expression in Pichia pastoris”, World J. Microbiol.
Biotechnol., 2011, 27, pp. 679-686.
75. />
K21-Sinh học thực nghiệm
Footer Page 19 of 27.

29

Đặng Thị Kim Anh