VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: “XÁC ĐỊNH TỈ LỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT
MANG GEN KPC VÀ NDM-1 TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ
VIỆT ĐỨC TỪ THÁNG 12/2016 ĐẾN THÁNG 4/2017”

Ngƣời hƣớng dẫn:

Th.s Nguyễn Thị Vân

Sinh viên thực hiện:

Phan Ngọc Hà

Lớp:

13-01
Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp tôi dã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin
được bày tỏ lòng biết ơn sau sắc tới những sự giúp đỡ này.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Th.s
Nguyễn Thị Vân – Trưởng khoa Vi sinh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức,
người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn KTV. Nguyễn Thành Đô và KTV. Đoàn

1.3. Carbapenem và cơ chế kháng Carbapenem: ...................................... 13
1.3.1. Carbapenem: ................................................................................. 13
1.3.2. Cơ chế kháng cabapenem: ........................................................... 14
1.4. Tổng quan về KPC và NDM-1:............................................................. 15
1.4.1. Tên loài và phân loại: ................................................................... 15
1.4.2. Lịch sử và phân bố: .................................................................... 17
1.4.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số vi khuẩn mang
gen KPC và NDM-1: ............................................................................... 18
1.4.4. Đặc điểm dịch tễ học:.................................................................... 23
1.4.5. Đặc điểm lâm sàng: ....................................................................... 26
1.4.6. Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn mang gen KPC và
NDM-1 ...................................................................................................... 28
1.5. Tình hình nghiên cứu tính đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang
gen KPC và NDM-1 ................................................................................ 30


1.5.1. Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC
và NDM-1 trên Thế giới. ........................................................................ 31
1.5.2. Tình hình đề kháng Carbapenem của vi khuẩn mang gen KPC
và NDM-1 ở Việt Nam: ........................................................................... 32
1.6. Ứng dụng CNSH vào xác định gen kháng kháng sinh Cabapenem: 33
1.6.1. Phƣơng pháp PCR: ....................................................................... 33
1.6.2. Phƣơng pháp Realtime PCR: ...................................................... 35
1.6.3. Cách xác định KPC và NDM-1: .................................................. 36
1.6.4. Quy trình sử dụng hệ thống realtime PCR ABI của Mỹ: ......... 36
PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:............................................. 40
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu: .............................................. 40
2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Hữu nghị Hà Nội Việt Đức làm
địa điểm nghiên cứu. ................................................................................. 40
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu: .................................................................. 40

KẾT LUẬN .................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 57
DANH MỤC BỆNH NHÂN


DANH MỤC BỆNH NHÂN
STT

TÊN BỆNH NHÂN

NGÀY NHẬN

NGÀY TRẢ

BỆNH PHẨM

KẾT QUẢ

1

BẾ XUÂN A

6/12/2016

8/12/2016

2

HOÀNG VĂN B


TRẦN THỊ F

19/12/2016

23/12/2016

7

VŨ HỒNG G

21/12/2016

26/12/2016

8

LÊ THANH H

28/12/2016

31/12/2016

9

NGUYỄN KHẮC K

27/12/2016

31/12/2016


3/1/2017

14

ĐINH VĂN N

9/1/2017

12/1/2017

15

NGUYỄN HỮU M

9/1/2017

12/1/2017


16

NGUYỄN MẠNH S

9/1/2017

16/1/2017

17

BÙI NGỌC Q


NGUYỄN ĐỨC R

16/2/2017

17/2/2017

22

NGUYỄN THỊ I

16/2/2017

17/2/2017

23

NGÔ THỊ Y

20/2/2017

20/2/2017

24

LÊ THỊ U

24/2/2017

27/2/2017


11/4/2017

29

NGUYỄN KIM D

5/4/2017

10/4/2017

30

LÊ THỊ H

12/4/2017

17/4/2017

31

NGUYỄN VĂN H

18/4/2017

21/4/2017

32

ĐÀO TIẾN A

36

PHẠM VĂN K

17/4/2017

21/4/2017

37

NGUYỄN TIẾN A

18/4/2017

21/4/2017

38

CẤN XUÂN V

20/4/2017

24/4/2017

39

ĐÀO ĐỨC Q

20/4/2017



29

2.1

Trang thiết bị dùng trong thí nghiệm

40

2.2

Trình tự mồi để phát hiện gen KPC và NDM-1

42

3.1

Phân loại bệnh phẩm theo khoa

47

3.2

Tỉ lệ bệnh nhân theo chuẩn đoán

48

3.3

Tỉ lệ các loại bệnh phẩm


51

3.9

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo từng loại vi khuẩn

51

3.10

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo bệnh phẩm

52

3.11

Tỷ lệ phân bố gen kháng thuốc theo khoa

53

1


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang


13

1.6

Đặc điểm các vùng mang gen kháng kháng sinh của các
chủng K. pneumonia

16

1.7

So sánh trình tự các amino acid của NDM-1 với các trình tự
amino acid của IMP1, IMP2, IMP-8,…..

16

1.8

Hình ảnh chụp hiển vi hình thái siêu cấu trúc của K.
pneumonia

18

1.9

Hình ảnh vi khuẩn K. pneumonia được nuôi trên thạch máu

18


DNA
Bp
CDC
ESBL
GARP
MBLs
MLST

KPC

NDM1
PCR
PFGE
WHO
RNA
MIC
kDa
SIM
AMC
TCC

Viết giải nghĩa tiếng
việt
Deoxyribonucleic Acid
Phân tử axit nucleic
Đơn vị đo trọng lượng
Base pair
của phân tử DNA
Centers for Disease Control and
Trung tâm kiểm soát và

Phân tử axit nucleic
Minimum inhibitory concentration
Nồng đọ ức chế tối thiểu
Đơn vị đo lượng phân tử
Kilo daton
của DNA
Enzyme ly giải
Seoul imipenemase
imipenem đặt theo tên
thủ đô Seoul
Amoxicicllin/ acid clavulanic
Một loại kháng sinh
Ticarcillin + clavulanate
Một loại kháng sinh
Viết đầy đủ tiếng anh

3


TZP
CAZ
CMX
CTX
ETP
CIP
GM
IPM
MEM
SXT
TGC


MỞ ĐẦU:
Cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở K. pneumoniae là tiết enzym
Klebsiella pneumoniae carabapenemase (KPC). Gen mã hóa KPC hiện diện
trên transposon Tn4401, một cấu trúc có khả năng giúp lan truyền tính kháng
làm cho gen này không chỉ hiện diện ở K. pneumoniae, mà đã chuyển sang
cho các vi khuẩn khác và gây nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao
trên thế giới. Thu thập được 26/41 chủng K. pneumoniae từ các chủng đề
kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức từ tháng7 đến
tháng 9 năm 2016. Khảo sát đặc tính kháng thuốc ở các chủng này cho thấy
các chủng đã đề kháng từ 9 đến 15 loại kháng sinh thường được sử dụng
trong điều trị nhiễm khuẩn; 88.4 đến 100% số chủng kháng với ampicillin và
cephalosporin các thế hệ; 96.2 đến 100% kháng carbapenem, 84.6 đến 100
0% kháng quinolone; 16% kháng amikacin. Sử dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử để xác nhận được sự hiện diện của gen mã hóa KPC trong 46.2% và
gen mã hóa NDM-1 trong 34.6% số chủng. Nghiên cứu đặc điểm phân tử của
các chủng mang gen mã hóa KPC cho thấy kiểu gen đề kháng carbapenem là
gen mã hóa KPC. Gen này được tạo dòng và biểu hiện thành công với cả
promoter tự nhiên và promoter T7 thành KPC tái tổ hợp ở dạng vạch protein
có kích thước 29 kDa và có khối lượng phân tử 29,542 Da, tương ứng với
kích thước và khối lượng theo tính toán của KPC. Protein KPC tái tổ hợp có
hoạt tính carabapenemase, và cho thấy có vai trò quan trọng trong hình thành
tính kháng carbapenem ở các chủng này.
Trong 2 năm gần đây bệnh viện Hữu nghị Việt Đức đã xuất hiện 1
chủng K. peumoniae kháng hầu hết các kháng sinh thử nghiệm: AMC, CFs,
Quinolon, AG, Carbapenem. Các chủng này được xác định gen KPC và
NDM-1 bằng kỹ thuật sinh học phân tử Realtime PCR với độ nhậy và độ đặc
hiệu cao.

5

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospital-acquired
infection hay nosocomial infection) là “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc
phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện không thấy
có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào. Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất
hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện”.

NKBV
48 giờ

Thời điểm nhập viện

Thời điểm nằm viện

Thời điểm ra viện

Hình 1.1. Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện
Để chẩn đoán nhiễm khuẩn bệnh viện, người ta thường dựa vào định
nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí nhiễm khuẩn bệnh viện. Hiện
nay, theo hướng dẫn từ Trung tâm Giám sát và Phòng bệnh Hoa Kỳ (CDC) và
các hội nghị quốc tế đã mở rộng định nghĩa ca bệnh cho các vị trí nhiễm
khuẩn khác nhau và đang được áp dụng để giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện
trên toàn cầu. Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học, các nhà khoa học
đã xác địnhcó khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra
tại bệnh viện.
Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động
đến sức khoẻ toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm
7


khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh

baumanii (A. baumannii) là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn nặng
trong các bệnh viện như nhiễm khuẩn vết mổ, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết,
đặc biệt khi các vi khuẩn này đã kháng lại các nhóm kháng sinh thế thệ mới
đắt tiền được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện như cephalosporin
và carbapenem là kháng sinh mạnh nhất hiện nay gia tăng một cách nhanh
chóng trên toàn thế giới. Điều này đe doạ thực sự đến hiệu quả điều trị cho
bệnh nhân tại các bệnh viện trên toàn thế giới [21, 28, 30, 41].
1.2. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
Kháng sinh được phát hiện ở thế kỷ 20 và lập tức đóng vai trò quan
trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng. Cùng với việc cải thiện
điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã
9


góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhiễm trùng và tuổi
thọ của con người đã được nâng cao. Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh
khác nhau đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho
công tác điều trị. Tuy nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng
kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu
trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra các giải pháp phòng chống một
cách hiệu quả.
1.2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh:
Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát
minh ra loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin, trong nghiên cứu
tác giả quan sát thấy ở trên các đĩa thạch bị nhiễm nấm penicillin (mold
Penicillium notatum) có khả năng ức chế sự phát triển của tụ cầu, ở trên các
đĩa thạch này xuất hiện một vòng vô khuẩn xung quanh khóm nấm do tụ cầu
không có khả năng mọc xung quanh khóm nấm. Tuy nhiên phải đến năm
1939, Ernst Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất
penicillin và được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh

ngại và thách thức lớn đối với nền y học hiện đại [5, 21, 25, 41].
1.2.2.2. Phân loại đề kháng
Về nguyên lý của kháng sinh là ức chế sự phát triển của vi khuẩn,
nhưng nếu trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn
vẫn phát triển được gọi là đề kháng [1]. Đề kháng được chia làm hai loại đề
kháng giả và đề kháng thật.
Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất
không phải do di truyền.
Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được
+ Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi
khuẩn không có vách thì không chịu tác động của các thuốc kháng sinh tác
động vào vách. [1]
11


+ Đề kháng thu được: là hiện tượng do một biến cố di truyền đột biến
hoặc nhận được gen đề kháng mà vi khuẩn đang từ trở nên có gen đề kháng
sinh. [1]
1.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tình trạng kháng kháng sinh của vi
khuẩn. Những cơ chế này có thể thay đổi đích tác động, tạo ra các enzym,
ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa
(tạo ra các isoenzym).
Bơm th o át d ò n g

Hình 1.4. Cơ chế

En zym p h á h ủy
kh án g sinh



phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền
dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [9, 28].
1.2.3.3. Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất
Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong
trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng
trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid [28]. Việc thâm
nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận
chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn
chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [28]. Cơ chế bơm đẩy (efflux
pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. coli và P.
aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào
[28].
1.3. Carbapenem và cơ chế kháng Carbapenem:
1.3.1. Carbapenem:
Carbapenem là một phân lớp của kháng sinh β- lactam, có phổ kháng
khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của β- lactam như penicillin, các
thế hệ cephalosporin. Carbapenem có nguồn gốc là một dẫn xuất của
Thienamycin, một hợp chất tự nhiên do Streptomyces cattleya ( S. cattleya)
sống trong đất tiết ra. Hoạt chất này có khả năng ức chế quá trình tổng hợp
peptidoglycan của tế bào vi khuẩn. Năm 1979 Kahan và cộng sự đã tách chiết
thành công thienamycin có độ tinh khiết cao >90%. Năm 2003, gen mã hóa
quá trình tổng hợp thienamycin của vi khuẩn S. cattleya được phát hiện và
giải trình tự, tổng hợp và phát triển thành các kháng sinh thuộc nhóm
carbapenem.
Carbapenem với cấu trúc hơi giống penicillin, gồm 1 vòng β- lactam
hình vuông nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ
nguyên tố lưu huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm 1 dấu nối đôi. Cấu
13


carbapenem này trên K. pneumoniae ít được nghiên cứu. [35, 36]
Ở K. pneumonia, vấn đề hệ thống bơm đẩy kháng sinh ra ngoài AcrAB
vó liên quan tính kháng carbapenem hay không vẫn chưa được làm rõ [19],
tuy nhiên đã có nghiên cứu chứng minh rằng sự biểu hiện vượt mức hệ thống
này có làm cho vật chủ mở rộng phổ kháng kháng sinh, chúng có khả năng
kháng chéo với chloramphenicol, quinolone [7].
1.4. Tổng quan về KPC và NDM-1:
1.4.1. Tên loài và phân loại:
- Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC): là một lớp enzyme lần đầu
tiên được tìm thấy trong K. pneumonia phân lập, thuộc lớp A, nhóm 2f, bị ức
chế bởi clavulanic. Tuy nhiên nó có thể được sản xuất bởi các sinh vật khác
bao gồm Serratie spp, Enterbacter spp, E. coli,...
+ KPC do gen mã hóa nằm trên plasmid, plasmid có thể ở dạng dung
hợp hay không dung hợp. Trình tự gen blaKPC nằm giữa trình tự transposon
Tn44001. Việc kết hợp gen blaKPC với các họ gen khác nằm trên plasmid
như Fluoroquinolone, aminoglycosides làm tăng cường tính kháng cho vi
khuẩn. Hơn nữa, plasmid là yếu tố di truyền di động, có thể dễ dàng truyền
ngang giữa các loài lân cận nên khả năng truyền tính kháng là rất cao.
- EnzymeNewDelhimetallo-beta-lactamase1(NDM-1) kháng
carbapenem nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay, đang là vấn đề lớn đe
dọa nghiêm trọng đến sức khóe cộng đồng. Vi khuẩn mang gen NDM-1
được phát hiện ở bệnh viện và cả ở cộng đồng. Phần lớn gen mã hóa
NDM-1nằm trên plasmid, điều kiện thuận lợi để lây lan gen NDM-1 trong
quần thể vi khuẩn gram âm.
15


+New Delhimetallo-betalactamase (NDM-1) là enzyme mới thuộc nhóm B
(metallo-beta-lactamase), có trọng lượng phân tử 28kDa, được Yong và cộng sự
phát hiện lần đầu tiên năm 2008 trên chủng K.pneumoniae và E.coli phân lập từ

- NDM-1 được phát hiện lần đầu tiên năm 2003 vào hiện đã lây lan ra
toàn thế giới [35][32][39]. Sự xuất hiện của vi khuẩn mang gen siêu
kháng thuốc này là dấu hiệu mở đầu cho một giai đoạn mới về tình trạng
vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới. Sự lây lan của vi khuẩn kháng
carbapenem mang gen NDM-1 không chỉ giới hạn trọng phạm vi loài mà
còn có thể lan truyền sang các loại vi khuẩn gam âm khác sống bình
thường trong đường tiêu hóa người [34][43].
- Sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh như NDM-1 và KPC được tạo
điều kiện bằng chuyển ngang gen (HGT) giữa các vi khuẩn [38]. Trong số các
tác nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, HGT tạo điều kiện kết hợp của các
gen kháng kháng sinh hiệu quả nhất từ khu vực địa lý khác nhau vào plasmid
kháng đa thuốc lây lan giữa các chủng. Tái tổ hợp và chuyển vị đã tạo ra quần
thể các plasmid đã liên quan đến kiến trúc nhưng khác nhau trong thành phần
của các băng cassette kháng thuốc kháng sinh [39].. Gen kháng kháng sinh
17