TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HOC ỨNG DỤNG

QUÁCH THỊ BẾ

NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI KHUẨN S.
ENTERITIDIS VÀ S. TYPHIMURIUM TRÊN PHÂN VỊT
NGHI BỆNH THƯƠNG HÀN TẠI QUẬN CỜ ĐỎ, Ô MÔN
THUỘC THÀNH PHỐ CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ – Tháng 12/2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH BÁC SĨ THÚ Y

NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VI KHUẨN S.
ENTERITIDIS VÀ S. TYPHIMURIUM TRÊN PHÂN VỊT
NGHI BỆNH THƯƠNG HÀN TẠI QUẬN CỜ ĐỎ, Ô MÔN
THUỘC THÀNH PHỐ CẦN THƠ

Giáo Viên Hướng dẫn:
ThS: Nguyễn Thu Tâm

Sinh viên thực hiện:
Quách Thị Bế

LỜI CẢM TẠ
Qua bao năm tháng được học tập dưới mái trường, hôm nay khi luận văn tốt
nghiệp đã hoàn thành tôi đã được sự giúp đỡ của rất nhiều người. Trong những giây
phút còn lại của thời sinh viên, tôi không biết nói gì hơn là:
Xin kính dâng lên cha mẹ
Người đã sinh thành, dưỡng dục và luôn đặt hết niềm tin yêu vào tôi lòng
biết ơn sâu sắc.
Xin chân thành biết ơn cô Nguyễn Thu Tâm
Người đã hết lòng tận tụy, chỉ bảo, động viên để tôi có thể hoàn thành luận
văn này.
Xin chân thành cảm ơn
Quý thầy cô trong bộ môn Thú Y và Chăn Nuôi đã tận tình giảng dạy và
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và làm đề tài.
Xin chân thành cảm ơn
Anh chị em của tôi, cùng tất cả bạn bè, những người bạn thân thiết trong và
ngoài lớp Thú Y K32 luôn luôn giúp đỡ, động viên cũng như chia sẽ những hạnh
phúc, khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin nói lời cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời
gian đọc, xem xét và đóng góp những ý kiến quý báu cho đề tài tốt nghiệp của tôi.
Dù mai này có sống và làm việc tại nơi nào, trong lòng tôi lúc nào cũng nhớ
đến những tình cảm quý báo này.

Quách Thị Bế

ii


MỤC LỤC
Trang
Trang duyệt ..................................................................................................... i

2.4 Bệnh thương hàn và ngộ độc do Salmonella spp. trên người.......... 20
2.4.1 Sơ lược về vi khuẩn S. typhimurium và S. enteritidis ............... 20
2.4.2 Cơ chế gây độc ........................................................................ 21
2.4.3 Một số thông tin về tình hình ngộ độc thực phẩm .................... 23
2.5 Tình hình nghiên cứu Salmonella spp. ở gia cầm trong và ngoài nước
............................................................................................................ 24
2.5.1 Tình hình nghiên cứu Salmonella spp. ở gia cầm trong nước ... 24
2.5.2 Tình hình nghiên cứu Salmonella spp. ở gia cầm ngoài nước .. 25
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ............... 27
3.1 Phương tiện thí nghiệm ................................................................. 27
3.1.1 Mẫu ......................................................................................... 27
3.1.2 Thiết bị dụng cụ ....................................................................... 27
3.1.3 Hóa chất và môi trường ........................................................... 27
3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm ................................................ 28
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................. 28
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập .............................................. 28
3.2.3 Phương pháp xác định khuẩn lạc.............................................. 30
3.2.4 Kiểm tra đặc tính sinh hoá ....................................................... 30
3.3 Phương pháp định danh tìm S. enteritidis và S. typhimurium ......... 34
3.4 Kháng sinh đồ ............................................................................... 35
3.4.1 Nguyên tắc .............................................................................. 35
3.4.2. Môi trường làm kháng sinh đồ ................................................ 35
3.4.3 Đĩa làm kháng sinh và cách điều chế canh khuẩn ..................... 35
3.4.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ .............................................. 35
3.4.5 Đọc kết quả ............................................................................. 35
3.5 Xử lý số liệu.................................................................................. 36
iv


Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 37

Hình 1: Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. ......................................................11
Hình 2: Vịt làm mẫu .........................................................................................28
Hình 3: Khuẩn lạc Salmonella spp. trên môi trường BGA ................................30
Hình 4: Khuẩn lạc Salmonella spp. trên môi trường XLD .................................30
Hình 5: Kết quả thử sinh hóa của Salmonella spp. ............................................33
Hình 6: Kháng huyết thanh chuẩn O4, O9 ........................................................34
Hình 7: Kháng huyết thanh chuẩn H:i, H:g,m ...................................................34
Hình 8: Kết quả thử tính nhạy cảm của vi khuẩn Salmonella spp. đối với kháng
sinh...................................................................................................................36

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1: Sự lây nhiễm của Salmonella spp. trong tự nhiên................................19
Sơ đồ 2. Quy trình phân lập vi khuẩn Salmonella spp .......................................29

vi


TÓM LƯỢC
Qua quá trình phân lập, nuôi cấy vi khuẩn Salmonella spp. trên 96 mẫu phân
của vịt còi cọc, ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, chậm lớn thu thập được tại 2 quận Cờ Đỏ và Ô
Môn thuộc khu vực thành phố Cần Thơ từ tháng 8 đến tháng 11 năm 2010 có 32
mẫu dương tính với Salmonella spp. chiếm tỷ lệ 33,33%. Kết quả kiểm tra tính nhạy
cảm của Salmonella spp. với các kháng sinh Norfloxacin (37,5%), Gentamycin
(34,4%), Neomycin (34,4%), Colistin (21,4%), Tetracycline (18,7%), Amoxicillin
(3,1%), Streptomycin (0.0%). Kết quả định danh 32 mẫu dương tính có 6 mẫu hiện
diện S. enteritidis chiếm tỷ lệ 18,75% và chưa tìm thấy S. typhimurium trên mẫu
khảo sát.

vii




Mục tiêu đề tài: Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp. trên phân của
những vịt còi cọc, ủ rủ, mệt mỏi, bỏ ăn, chậm lớn.
Định danh vi khuẩn S. enteritidis và S. typhimurium trên mẫu nói trên.
Thử độ nhạy của vi khuẩn đối với kháng sinh.

-2-


Chương 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Một số đặc điểm sinh học của vịt.
2.1.1 Đặc điểm da và lông.
Da
Da vịt khá mỏng và không có sự thay đổi theo định kỳ. Không có tuyến mồ
hôi ngoại trừ tuyến phao câu hay còn gọi là tuyến dầu nằm ở phía trên của phần
đuôi. Vịt dùng mỏ rỉa chất dầu nhờn được sản xuất ra từ tuyến này để trải trên bề
mặt bộ lông, có tác dụng đặc biệt quan trọng, như một chất chống thấm nước làm
cho vịt nổi trên mặt nước, giúp vịt bơi lội dễ dàng và không bị thấm lạnh qua lông
khi ngâm lâu trong nước.
Vùng da mỏ của vịt được bao phủ bằng một lớp sừng mỏng, tiếp giáp với các
đầu mút dây thần kinh nên nhạy cảm như một cơ quan xúc giác. Vùng da chân của
vịt cũng được bao phủ bởi lớp sừng không thay đổi.
Lông vịt
Vịt cũng như các loại gia cầm khác, trên bề mặt thân mình được bao bọc bởi
một lớp lông vũ có chức năng như cơ quan điều chỉnh thân nhiệt cho cơ thể. Nhiệm
vụ chính của bộ lông vũ là bảo vệ cho vịt không bị nhiễm lạnh. Giữa lớp lông vũ và
da là lớp không khí, nhờ đó mà thân nhiệt luôn được duy trì ở mức cao.
Vịt con khi nở ra có một lớp lông tơ mềm, mịn và mượt mà nhưng lông này

có trong diều. Điều hòa sự co bóp của diều do dây thần kinh phế vị và thần kinh phó
giao cảm.
Dạ dày tuyến
Dạ dày tuyến nằm ở giữa diều và dạ dày cơ, dạ dày tuyến tiết ra dịch và men
tiêu hóa sơ bộ. Cơ vòng của dạ dày tuyến phát triển mạnh và chắc.
Thức ăn không được giữ lâu ở dạ dày tuyến mà được thấm dịch chứa men
pepsin rồi chuyển xuống dạ dày cơ. Các dây thần kinh phế vị, dây thần kinh giao
cảm và hệ thần kinh trung ương điều khiển sự chế tiết dịch ở dạ dày tuyến.
Dạ dày cơ
Đây là nơi tập trung số lượng lớn của cơ, phía trong phủ một lớp màng nhầy
rất dày có tác dụng chống lại sự ăn mòn của dịch tiêu hóa và khi dạ dày co bóp
nghiền nhỏ thức ăn thì sỏi sạn không làm tổn thương dạ dày cơ. Màng nhầy dạ dày
cơ có cấu tạo 2 lớp tế bào biểu bì phủ lớp màng và một lớp nhầy với mô liên kết
chặt phía dưới gồm nhiều tuyến hình ống tiết ra dịch nhầy thấm ướt thức ăn trong
khi dạ dày cơ co bóp nghiền nhỏ thức ăn.

-4-


Ruột non
Đoạn trên của ruột non liền với dạ dày cơ, nó gấp khúc gọi là tá tràng. Bên
trong của khoang ruột non là tuyến dịch tiêu hóa và lớp nhung mao nằm khắp bề
mặt trong của ruột non. Bên trong lông mao là những mao dẫn. Thành ruột được
cấu trúc bởi 2 lớp cơ: cơ vòng và cơ dọc.
Có 2 dạng nhu động ruột: nhu động thuận và nhu động ngược nhờ hệ cơ
vòng và cơ dọc, có 3 tác dụng: đảo trộn, tiêu hóa và hấp thu thức ăn tốt hơn.
Ruột già
Ruột già bao gồm manh tràng và trực tràng. Manh tràng là 2 nhánh xuất phát
từ phần cuối của ruột non. Phần tiếp theo là trực tràng, nối liền với lỗ huyệt.
Túi mật và ống mật

khó khăn.
Bệnh dịch tả vịt: bệnh do nhóm herpes virus gây ra cho các loại thủy cầm với
những biểu hiện: uể oải, xõa cánh, đi lại khó khăn, không chịu vận động, nằm một
chỗ.
Bệnh tụ huyết trùng: do pasteurella multocida gây ra với những biểu hiện: có
dịch nhờn từ hốc mũi chảy ra, đi phân màu vàng hoặc xanh đôi khi lẫn máu, chết
đột ngột, chết vào ban đêm.
Đặc biệt bệnh thương hàn vịt do Salmonella spp. gây ra. Bệnh không những
gây hại cho đàn vịt nuôi mà còn gây nguy hiểm cho cả người khi ăn phải thức ăn
nhiễm bệnh nấu không chín.
2.2 Bệnh thương hàn trên vịt.
Bệnh thương hàn vịt hay còn gọi là bệnh Salmonella ở vịt. Vi khuẩn này
thường gây bệnh cấp tính ở vịt con, gây chết tỷ lệ cao 1–60%. Không những thế mà
còn gây nguy hiểm cho người khi dùng phải sản phẩm thịt và trứng đã nhiễm vi
khuẩn này. (Nguyễn Xuân Bình, 1999).
2.2.1 Nguyên nhân và phương thức truyền lây.
Nguyên nhân
Bệnh do vi khuẩn Salmonella ở vịt thường do các chủng S. typhimurium, S.
enteritidis, S. anatum, …gây ra. Vịt ở bất cứ lứa tuổi nào cũng có thể nhiễm bệnh.
Phương thức truyền lây
Bệnh thương hàn thường phổ biến ở vịt, ngỗng, bồ câu, đôi khi cũng thấy ở
gà và gà tây. Gia cầm non thường mắc bệnh nặng hơn gia cầm lớn. Trong tự nhiên
gia cầm lớn chỉ bị bệnh khi sức đề kháng giảm sút. Bệnh nguy hiểm cho người khi
ăn phải thịt gia cầm chứa bệnh.
Bệnh lây lan bằng nhiều cách. Bệnh lây lan qua trứng, gia cầm non nở ra từ
trứng bệnh không những tự nó mắc bệnh mà còn lây cho những con khác cùng lứa

-6-



trùng. Ngoài ra, cũng có trường hợp sau khi nhiễm trùng gia cầm bị bệnh ẩn tính,
không có triệu chứng. Nhưng một lúc nào đó nếu sức đề kháng của cơ thể mất thăng
bằng bệnh sẽ phát ra. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

-7-


Chất chứa căn bệnh.
Vi khuẩn chứa trong máu vịt bệnh, trong gan, lách, tuỷ xương, buồng trứng,
phôi trứng, dịch hoàn, các ổ bệnh và phân. (Phan Thanh Phong, 1997).
2.2.3 Triệu chứng
Khi vịt có tiềm tàng bệnh, triệu chứng đầu tiên là tỷ lệ trứng ung và phôi chết
hay trứng nở không cao. Vịt có thể chết ngay trong lồng ấp hoặc những ngày đầu
sau khi nở.
Vịt bệnh tiêu chảy nặng, mất nước nghiêm trọng, ủ rủ, xã cánh, lông dựng
ngược, sau đó quỵ và suy sụp. Tỷ lệ vịt ốm cao, nhưng tỷ lệ chết chỉ dưới 10%.
Triệu chứng thần kinh chủ yếu là loạng choạng, run, lắc đầu và ngoẹo cổ ở một số
con.
Bệnh nặng nhẹ phụ thuộc nhiều ở chế độ chăm sóc, quản lý, thiếu vitamin A,
các ảnh hưởng stress, …
Bệnh do Salmonella có thể là bệnh thứ phát sau khi phát các bệnh viêm gan
siêu vi trùng và nhiều bệnh do siêu vi trùng khác.
Sau khi bị nhiễm Salmonella, trong thời gian ấp nở, vi khuẩn sinh sôi nảy nở
và làm chết phôi, lòng đỏ không tiêu và chuyển màu thẩm.
Tổn thương đại thể là hoại tử điểm ở gan, thận, manh tràng sưng lên, trong
chứa từng cục như bã đậu. Niêm mạc trực tràng viêm và trương lên chứa nhiều dịch
trắng.
Ở vịt con
Nếu nhiễm bệnh từ mẹ hoặc vỏ trứng vào phôi thì phôi bị chết trước khi nở
(vịt sát).

Viêm bao tim, bao tim dày lên, trong bao tim có dịch thẩm xuất fibrin.
Lách sưng to, ruột viêm, hoại tử, loét thành từng vệt trên niêm mạc.
Buồng trứng méo mó, dị hình, có màu vàng nâu, xanh đen. Viêm buồng
trứng dẫn đến viêm phúc mạc làm cho ruột, ống dẫn trứng và thành bụng dính lại
với nhau.
Một số con viêm khớp mãn tính.
Ở con trống có những nốt hoại tử to nhỏ ở dịch hoàn.
2.3 Sơ lược về vi khuẩn Salmonella spp.
2.3.1 Lịch sử phát triển và phân loại của Salmonella spp.
Salmonella mang tên của bác sĩ Thú y người Mỹ Daniel E. Salmon vào năm
1885 nhưng người có công lớn nhất và là người đầu tiên có công phát hiện ra S.

-9-


choleraesuis là Theobald Smith, một thuộc cấp của Daniel E. Salmon, lúc đó đang
nghiên cứu về tính quá mẫn.
Năm 1934, theo đề nghị của hội nghị sinh học quốc tế, để kỷ niệm người đầu
tiên tìm ra vi khuẩn, tên chính của vi khuẩn được đặt tên là Salmonella.
Theo D’ Aoust (2000), đã nêu lên một vài con đường phân chia loài trong
lịch sử phân chia loài. Một vài nhà nghiên cứu dựa trên đặc điểm sinh hoá, AND
đơn và thành phần điện enzym để sử dụng cho việc phân nhóm Salmonella.
Những nhà nghiên cứu dựa trên ngoại hình, đặc điểm của tính tương đồng
của gene cho là S. choleraesuis có thể chia làm 7 loại phụ bao gồm loại phụ S.
choleraesuis, S. salamae, S. aionae, S. diarizonae, S. houtenae, S. bongori và S.
indica.
Năm 1987, một nhóm các nhà nghiên cứu khác cũng dựa trên tính tương
đồng của gene nhận thấy rằng S. enterica có thể chia làm 7 loài phụ như trên thay
vì S. choleraesuis. Năm 1989, loài phụ S. bongori được nâng lên mức loài.
Năm 1995, các nhà khoa học đã chia nhóm gene của Salmonella ra làm 2


indica
Salmonella bongori

11
20

Tổng

2422

- 10 -


2.3.2 Hình thái vi khuẩn
Salmonella spp.
Salmonella là một loại vi
khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu
tròn, kích thước 0,4–0,6 x 1–3
 m, không hình thành giáp mô
và nha bào. Đa số các loài
Salmonella đều có khả năng di
động mạnh do có từ 7–12 lông
xung quanh thân (trừ S.
gallinarum, S. pullorum). Vi Hình 1: Hình thái vi khuẩn Salmonella spp.
khuẩn dễ nhuộm với các thuốc
nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc
hơi đậm ở hai đầu. (Nguyễn Như thanh, 1997).
2.3.3 Đặc tính nuôi cấy.
Vi khuẩn Salmonella vừa hiếu khí, vừa kỵ khí, dễ nuôi cấy trong nhiệt độ


-

+H

+H

-

+H

-

S.
echottmuelleri

+H

+H

+H

+H

+H

+

S. hirschfeldii


+H

+H

+H

+H

+

S. typhisuis

+H

+H

+H

-

+H

-

S. enteritidis

+H

+H


-

+

+, -

H: sinh hơi,+,- : thay đổi

Chuyển hoá đường: mỗi loài Salmonella có thể lên men và chuyển hoá
đường nhất định và không đổi.
Môi trường để kiểm tra tính chất lên men đường thường là môi trường nước
peptone cho thêm một loại đường với tỷ lệ 0,5% và chất chỉ thị màu như xanh
bromothymon, tía bromocrezon, hoặc đỏ phenon.
Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi các nhóm đường: glucose,
maltose, mannit, galactose, levulose, … Một số loài lên men nhưng không sinh hơi:
S. abortus bovis, S. typhi, S. gallinarum, S. enteritidis, …
Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường lactose, saccharose trừ
S. arizonae.
Enzym khử Cacboxyl. Khoảng 96% Salmonella đều tiết ra enzym khử
cacboxyl đối với lysine, arginine, ornithine.
Phản ứng H2S dương tính (trừ S. parataphy A, S. typhisuis, S. choleraesuis).
Phản ứng indol âm tính.

- 12 -


Phản ứng VP, MR âm tính.
2.3.5 Tính biến dị.
Vi khuẩn Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên.
Biến dị khuẩn lạc S => R. Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S



kháng nguyên đặc hiệu và kháng nguyên không đặc hiệu chung cho nhiều loại biến
chủng cộng đồng. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella gồm 3 nhóm là kháng nguyên O,
kháng nguyên H và kháng nguyên Vi.
Bảng 3. Công thức kháng nguyên của một số chủng Salmonella spp. (Theo Popoff, 2001)
Nhóm vi
khuẩn

Loài vi khuẩn

Kháng nguyên Kháng nguyên tiêm mao (H)
thân O
Phase 1
Phase 2

A

S. paratyphi A

1,2,12

A

-

B

S. paratyphi B


S. typhi

9,12,Vi

d

-

S. enteritidis

1,9,12

g,m

-

S. gallnarum

1,9,12

-

-

S. pullorum

9,12

-

kết với kháng huyết thanh O. Một trong những kháng nguyên đặc biệt được biết đến
đó là kháng nguyên Vi (Kenneth, 2005).
Kháng nguyên Vi cuả Salmonella không phức tạp, chỉ có thể có hoặc không
có ở 3 chủng huyết thanh học là S. typhi, S. paratyphi C và S. dublin (Kenneth,
2005).
Bản chất của kháng nguyên Vi là phức hợp glucid – lipid – polypeptid gần
giống như kháng nguyên O, kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây
bệnh.
Kháng nguyên H.
Kháng nguyên H bản chất là những protein không bền với nhiệt độ. Kháng
nguyên này chỉ có ở Salmonella có lông. Đây là nhóm kháng nguyên góp phần cho
việc xác định một cách chính xác các chủng Salmonella, kháng nguyên H bao gồm:
Salmonella có phase 1. Có tính chất đặc hiệu bao gồm 28 loài kháng nguyên
lông được biểu thị bằng chữ La tinh thường: a, b, c, d, …, z.
Salmonella có phase 2. Không có tính chất đặc hiệu, loài này có thể ngưng
kết với các loài khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E. coli (Nguyễn Như
Thanh, 1997). Gồm có 6 nhóm được biểu thị bằng chữ số Ả rập: 1, 2, 3, 4, 5, 6, …
hay chữ La tinh thường: e, n, x, …
Một vài chủng huyết thanh của loài S. enterica như phụ loài S. enteritidis, S.
typhi, … sản xuất ra kháng nguyên lông mà những kháng nguyên lông này luôn có
những tính kháng nguyên đặc hiệu giống nhau. Lúc này những kháng nguyên này
được gọi là phase 1. Hầu hết các chủng Salmonella còn lại có thể sản sinh ra 2
nhóm kháng nguyên lông đặc hiệu trên cơ thể chúng, những vi khuẩn này được gọi
là có phase 2 kháng nguyên H.
Nghiên cứu các kháng nguyên O, H, Vi người ta xây dụng bảng công thức
kháng nguyên.
2.3.8 Độc tố của vi khuẩn.

- 15 -


đặt vào bụng chuột lang để nuôi. Sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5
đến 10 lần. Sau cùng đem lọc, nước lọc này có khả năng gây bệnh cho động vật thí
nghiệm. Ngoại độc tố hình thành trong cơ thể và trong môi trường nuôi cấy kỵ khí.
Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.

- 16 -