BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT
HỢP VỚI NAA VÀ 2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN
(Lonicera japonica Thunb)
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành

: 111

GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH
SVTH : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN
MSSV : 105111053

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KTCN TPHCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
------------------------

KHOA: MT và CNSH

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Toàn bộ Đồ án

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày …… tháng……..năm 2009
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

( Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): ....................................................
Đơn vị:...................................................................................
Ngày bảo vệ: .........................................................................
Điểm tổng kết: .......................................................................
Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: ................................................

(Ký và ghi rõ họ tên)


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh,
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền
đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.
 Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp


1.1.

Đặt vấn đề ................................................................................................2

1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu............................................................4

1.2.1.

Mục đích ..................................................................................................4

1.2.2.

Nội dung nghiên cứu................................................................................4

2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................5

2.1.

Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật................................................6

2.1.1.

Khái niệm.................................................................................................6

2.1.2.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất định .................................................................15
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất định ......................................................................17
2.1.8.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi
cấy in vitro.............................................................................................18

2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy........................................................................18
2.1.8.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ....................................................21
2.1.9.

Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô .............26

2.2.

Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa .....................................................27

2.2.1.

Vị trí phân loại ......................................................................................27

2.2.2.


3.2.2.

Trang thiết bị và dụng cụ ......................................................................38

3.2.3.

Các loại môi trường...............................................................................39

3.2.4.

Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in vitro ................................40

3.3.

Phương pháp bố trí thí nghiệm..............................................................40

3.3.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung
dịch Javel 7% ........................................................................................40

3.3.2.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách đặt mẫu lá lên môi trường
nuôi cấy đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu ............................ 41

3.3.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA
kết hợp với 2,4 D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim

kết hợp với 2,4 D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim
Ngân Hoa ..............................................................................................50

4.3.1.

Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng
BA kết hợp với 2,4 D lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa ........................................................................................................50

4.3.2.

Thí nghiệm 3.2 : Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng
BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân
Hoa ........................................................................................................58

5.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................... 68

5.1.

Kết luận .................................................................................................69

5.2.

Đề nghị ..................................................................................................70

6.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


 NAA

: – Naphthalene acetic acid

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 3.1.

Môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình
thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 3.2.

Môi trường MS bổ sung NAA và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình
thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa

Hình 2.2.

Một số hình ảnh về Kim Ngân Hoa

Hình 2.2.

Hoa Kim Ngân phơi khô

Hình 4.1.

Cách đặt mẫu lá

Hình 4.2.

Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá được đặt theo 2 cách khác nhau

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu
lá Kim Ngân Hoa

Hình 4.4.

Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu
lá Kim Ngân Hoa

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).
Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trị ung thư trong Đông
và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực
tràng,..
Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp, hoa thơm,
mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt của ánh nắng
mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành tre, mành nhựa và mái tôn
chống nóng. Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO2), nhả dưỡng khí (O2) làm sạch môi
trường, tạo bầu không khí trong lành.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với số
lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thị
trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ phẩm
dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90% tổng số
mỹ phẩm được sản xuất.
Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu,
nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập.
Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sản
xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh của
Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thị trường
cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore.
Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệu dược
liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thị trường là hàng nhập lậu.

đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp để có thể
nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứng được nhu
cầu tiêu thụ cho thị trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần thiết.
1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

1.2.1.

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

Mục đích

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng
thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trị dược lý trong
cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược.
1.2.2.

Nội dung nghiên cứu

Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá của
cây Kim Ngân.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của cơ
thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mối tương
quan giữa các bộ phận trong cây.
Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó
cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thích để
tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tế bào
(trước khi cho ra cây hoàn chỉnh).
Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính
xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể
khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân
biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển của cây
trồng theo chiều hướng mong muốn.
Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành
nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta tìm ra được
những cơ chế miễn dịch thực vật. Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này thì
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nên đỡ
tốn kém hơn rất nhiều.
2.1.2.2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còn
có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống.
Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản
xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong


giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây sạch bệnh
vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy, đồng thời
cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi
trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các
nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.
 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có
thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh
dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.
 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống
kế tiếp.
 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.
 Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.
 Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất
thụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng
phương pháp nhân giống in vitro.
Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có những
bất lợi sau:
 Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.
 Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.
 Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây.
 Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn công bởi
một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, cần
phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận.
 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyền phù
tế bào được lặp lại nhiều lần.
 Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô
Nguồn gốc mẫu cấy
Đỉnh sinh trưởng
Chồi đỉnh
Chồi bên

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Kích thước

Mẫu được tách

0,5 – 1 mm

Tế bào đỉnh sinh trưởng

0,5 – 1 cm

Chốp đỉnh có chứa một
phần thân

0,5 – 1 cm

Chồi bên có chứa một
phần thân, lá và chồi nách


Đồ án tốt nghiệp

Mẫu lá

Phiến lá non được đặt trên
môi trường, mặt dưới đặt
trên mặt thạch
Mẫu rễ được đặt trên mặt
thạch
Mẫu được đặt trên mặt
hay được cấy chìm phân
nữa vào môi trường
Chồi non
Hạt phấn trong túi phấn

Các bước nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau:
2.1.6.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch
bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng.
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm
tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô
trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và
khử trùng mẫu cấy.
+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu
bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các
nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng
mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate
bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene
sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

nâu của mẫu cấy nên:
 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ
nhất.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi
trường.
 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sáng
trong 1 – 2 tuần đầu.
 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang
môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao.
 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuôi
cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.
2.1.6.2. Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể
nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta
thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.
Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các
chất hữu cơ khác.
2.1.6.3. Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy

xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ.
2.1.7.

Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro

Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà
phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:
 Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương
quan mới được hình thành.
 Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế bào).
 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơ
quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
 Sự hình thành cơ quan
 Sự phát triển cơ quan
 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:
 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh

 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên
 Vị trí của mẫu cấy trên cây
 Thời gian thu mẫu trong năm
 Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh
 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần dưỡng chất trong
môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá

phận của cây con (Anonymous, 1984).
 Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ).
 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định
 Ánh sáng
Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là có một
số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik
và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik,
1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng các mẫu cấy
lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin và được xử lý
với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi lớn hơn là được nuôi cấy dưới
ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh
sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng lượng tươi của chúng tương tự nhau và
nhiều hơn trên môi trường không có cytokinin.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ
như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).
 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:
 Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo
chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và
Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966).
 Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi
auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch,
1968).
 Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợp Lili
(van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975).
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên




Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in

vitro
2.1.8.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên