BỘ GIÁO DỤC

VIỆN KHOA HỌC VÀ

VÀ ĐÀO TẠO

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

NGUYỄN THỊ NHÃ

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO
ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG
STEINERNEMA ROBUSTISPICULUM TN 21”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2009

1


VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

“NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ SẢN PHẨM TRAO
ĐỔI CHẤT CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG

thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phòng Hệ thống học phân tử
và Di truyền bảo tồn và phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
làm thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm trong công
việc để tôi có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian qui định.
Tôi cũng xin cảm ơn các đồng chí lãnh đạo trường THPT Gia
Bình - Bắc Ninh, cùng các đồng chí trong tổ bộ môn đã tạo điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân
trong gia đình đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian làm luận văn.
Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./.
Hà nội, ngày 19 tháng12 năm 2009
Học viên
Nguyễn Thị Nhã

3


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết
quả và số liệu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố.

Học viên:

Nguyễn Thị Nhã

4


Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng máy dò tia tử ngoại (High

LB

performance liquid chromatography/ultraviolet)
Một môi trường nhân nuôi vi khuẩn (Luria-Bertani)

IJ

Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile)

MeOH

Methanol CH3OH

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance)

RFLP

Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction

SEM

Fragment Length Polymorphism)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope)

TTC


1.1.3. Cơ chế gây bệnh của EPN

14

1.1.4. Vòng đời của tuyến trùng EPN

15

1.1.5. Quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn

16

15

1.1.4.1. Vai trò của tuyến trùng

16

1.1.4.1. Vai trò của VKCS

17

1.1.6. Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới và trong nước

17

1.1.6.1.Tình hình nghiên cứu EPN trên thế giới

17


1.3.1. Xenorhabdus

28

1.3.2. Photohabdus

29

1.4.Các chất trao đổi thứ cấp

30

1.4.1 Nguồn gốc và hoạt tính sinh học

30

1.4.1.1. Nguồn gốc

31

1.4.1.2. Hoạt tính sinh học

32

1.4.2. Công thức hoá học

38

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU



44

2.3.5. Giải và phân tích trình tự ADN

45

2.3.6. Phân tích số liệu

46
47

2.4. Phương pháp tách chiết hoạt chất

47

2.4.1. Nhân nuôi vi khuẩn In-vitro
2.4.2.Tách chiết hoạt chất

47

2.3.2. Tinh sạch

48

2.3.3. Xác định cấu trúc hóa học

52

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

63

PHỤ LỤC

69

7


MỤC LỤC BẢNG
Trang

Bảng 1

Số đo của tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21

21

Bảng 2

Các loài tuyến trùng và VKCS tương ứng (Poinar G.O)

30

FN, 1992)
Danh mục các chất kháng sinh và hoạt tính của chúng

37

Bảng 8

được biết từ Xenorhabdus spp
Thành phần hỗn hợp cho PCR

43

Bảng 9

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

44

Bảng10

Thành phần hỗn hợp phản ứng giải trình tự ADN

45

Bảng11

Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự ADN

45


24

Hình 4

Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21

25

Hình 5

Mẫu RFLP vùng ITS của loài Steinernema robustispiculum

26

TN21 được cắt với 17 enzym
Hình 6

Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của Steinernema

28

robustispiculum với 13 loài Steinernema dựa vào sự phân tích
ITS-rDNA
Hình 7

Công thức hoá học của một số chất kháng vi sinh vật từ

40

Xenorhabdus và Photohabdus


53

Hình 11
Hình 12

lạc

và

tế

bào

VKCS

với

Steinernema

49

52

robustispiculum TN21
Hình 15

Mối quan hệ họ hàng của VKCS phân lập từ Steinernema

54

Trong những năm gần đây, côn trùng có hại, bệnh của loài người và cây
trồng ngày càng gia tăng. Quá trình sử dụng thuốc trừ sâu hóa học kéo dài
không những ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể sinh vật mà còn dẫn đến sự
kháng thuốc của các sâu bọ, vi khuẩn, vi rút và nấm cũng như hậu quả nặng
nề là sự ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí. Sức khoẻ của nhân loại
đang đứng trước nguy cơ đe doạ. Cũng vì thế mà hiện nay có hàng loạt thuốc
trừ sâu hoá học phải đưa vào trong danh mục cấm sử dụng. Tương tự trong
lĩnh vực y học, những thuốc kháng sinh mà trước đây tiêu diệt những tác nhân

10


gây bệnh - vi khuẩn và nấm thật sự dễ dàng, ngày nay lại có thể trở thành vô
hiệu bởi sự kháng thuốc của những tác nhân này. Hiện tượng nhờn thuốc thật
sự đáng lo ngại, đòi hỏi các nhà khoa học cần thiết phải nghiên cứu tìm ra các
loại thuốc mới đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của con người trong thời đại ngày
nay. Hơn nữa, những bệnh như bệnh lao và các bệnh ưng thư luôn có xu
hướng gia tăng số người mắc và tỉ lệ tử vong vì vậy mà tổ chức y tế thế giới
khẩn cấp khẩn thiết đối với những chính phủ tăng cường nghiên cứu của họ
để ngăn ngừa sự lây lan của dịch bệnh. Do đó, một nhu cầu khẩn cấp những
thuốc kháng vi sinh vật mới để kiểm soát những căn bệnh một cách có hiệu
quả đang trở nên cực kỳ cấp bách. Hiện nay, nguồn các hoạt chất tự nhiên
được cung cấp chủ yếu từ xạ khuẩn (actinomycetes) tuy nhiên, ngành công
nghiệp dược phẩm đang tìm kiếm những chất kháng vi sinh vật từ những
nguồn khác nữa với hy vọng nhanh chóng tìm ra những chất kháng vi sinh vật
thích hợp có hiệu lực cao và hoạt phổ rộng .
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (entomopathogenic nematodes
– EPN) hiện đang là đối tượng để tìm các hoạt chất sinh học mới từ sản phẩm
trao đổi chất thứ cấp của các vi khuẩn cộng sinh cùng với chúng,
Xenorhabdus ở Steinernema và Photorhabdus ở Heterorhabditis. Nhiều


rất an toàn đối với người, động vật và thực vật. Chúng có thể giết chết côn trùng
vật chủ chỉ trong 24-48 h.
1.1.2. Phân loại
EPN gồm có 2 giống Steinernema và Heterorhabditis.
Phylum: Nematoda
Class: Chromadorea
Order: Rhabditida
Sub-order: Tylenchina
Infra-order: Panagrolaimomorpha
Super-family: Strongyloidoidea
Family: Steinernematidae
Genus: Steinernema
Neosteinernema
Sub-order: Rhabditina
Infra-order: Rhabditomorpha
Super-family: Strongyloidea
Family: Heterorhabditidae
Genus: Heterorhabditis
Vị trí phân loại của EPN theo De Ley and Blaxter, 2002

1.1.3.Cơ chế gây bệnh của EPN
Cơ chế gây bệnh của EPN là nhờ vào VKCS mà ấu trùng của chúng
mang theo trong ruột (Akhurst, 1983; Poinar, 1990). Các IJ xâm nhập vào
xoang máu của côn trùng vật chủ qua những lỗ mở tự nhiên (miệng, hậu môn,
tuyến tơ hoặc nơi có lớp cutin mỏng). Trong xoang máu của côn trùng vật
chủ, ấu trùng giải phóng VKCS. Ở đây, các vi khuẩn này nhân lên nhanh
13



Thực chất mối quan hệ giữa tuyến trùng và VKCS là hiện tượng cộng
sinh mà cả 2 phía cùng có lợi.
1.1.5.1. Vai trò của tuyến trùng
Tuyến trùng mang vi khuẩn trong ruột mình, bảo vệ vi khuẩn khi ở
ngoài côn trùng vật chủ; khi ở ngoài môi trường, vi khuẩn không tồn tại ở
dạng tự do.
Tuyến trùng còn đóng vai trò quan trọng là vector vận chuyển vi khuẩn
vào xoang máu của côn trùng vật chủ, bảo vệ vi khuẩn trong xoang máu côn
trùng vật chủ bằng cách chúng tiết ra một số chất có tác dụng làm trung hoà và
làm mất tác dụng của kháng thể do côn trùng tiết ra để chống lại vi khuẩn. Nhờ
vậy mà VKCS có thể sinh sôi nhanh chóng trong ruột côn trùng.
15


1.1.4.2. Vai trò của VKCS
VKCS sản sinh độc tố giúp giết chết côn trùng vật chủ, chuyển biến xác
côn trùng vật chủ thành hỗn hợp chất chất dinh dưỡng cho tuyến trùng phát
triển ( Akhust và Dunphy, 1993). Độc tố do VKCS tiết ra làm côn trùng chết
một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h. Thời gian giết chết côn trùng vật
chủ khác nhau tuỳ tổ hợp tuyến trùng – VKCS và cũng phụ thuộc vào loại côn
trùng vật chủ.
Vi khuẩn còn cung cấp nguồn thức ăn cho côn trùng. Khi mới bắt đầu
xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng sử dụng VKCS vừa giải phóng từ
cơ thể chúng và sinh sôi trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng
của chúng, nhờ đó các ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 nhanh chóng phát triển sang
tuổi 4 và đạt đến trưởng thành. Từ thế hệ thứ II, tuyến trùng chuyển sang dinh
dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn hoạt hoá.
VKCS hoạt hoá xác chết côn trùng nhờ việc tiết ra các enzyme. Các
enzyme do vi khuẩn tiết ra có tác dụng hoạt hoá mô cơ thể côn trùng thành
nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Nhờ đó từ thế hệ thứ II, tuyến trùng

nay đã đạt được một số thành tựu đáng kể. Các nhà khoa học đã điều tra, phân
lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế xâm nhập và phát
triển của tuyến trùng EPN. Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất tuyến
trùng EPN, bước đầu xản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng - thuốc trừ sâu
sinh học đáp ứng cho nền nông nghiệp nước nhà. Do EPN có khả năng ký
sinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại khác nhau nhưng lại an toàn cho người,
động vật, thực vật và môi trường.
EPN ở việt Nam có tính đa dạng khá cao. Hiện nay đã phân lập được
khoảng hơn 40 chủng từ các vùng sinh thái khác nhau . Trong đó điều đáng quan
tâm chú ý là các chủng VKCS với 2 giống tuyến trùng nói trên: Xenorhabdus
cộng sinh với Steinernema và Photohabdus cộng sinh với Heternorhabditis.

17


Tại Việt Nam, kể từ năm 1999, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng. Cho tới nay, đã sản xuất
được bảy chế phẩm trong đó một chế phẩm được sản xuất từ tuyến trùng nhập
nội và sáu chế phẩm sử dụng sáu chủng tuyến trùng bản địa. Kết quả thử
nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài sâu hại
khác nhau. Thử nghiệm trên quy mô 1-2 ha cho thấy các chế phẩm diệt được
sâu keo da láng hại nho ở Ninh Thuận (tỷ lệ sâu chết là 70%), sâu xám hại
thuốc lá ở Ba Vì (85-90%), bọ hung đen hại mía ở Thanh Hóa (50-65%). Hiện
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã chuyển giao công nghệ sản xuất cho
Ninh Thuận ở quy mô một xưởng sản xuất nhỏ và tiếp tục chuyển giao cho
một số nơi khác (Phan Kế Long và cộng sự, 2003).
1.2. Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21
1.2.1. Địa điểm phát hiện
Tuyến trùng Steinernema robustispiculum TN21 được phân lập từ
đất rừng ở Sa Sơn, Sa Thầy thuộc dãy núi Chư Mom Ray Nam, tỉnh Kon


1433  106

3206  249

712  43

(1320 –

(2745 - 3765)

(642 – 778)

1665)

193  18

28  3

127  15

(165 – 240)

(26 – 35)

(105 – 150)

6  1 (5 - 8)

18

95  5

226  6

120  7 (115

(89 – 104)

(216 – 239)

– 152)

173  7

148  9

84  4

(162 – 186)

(132 – 165)

(80 – 100)

120  5

29  5

75  5


143

33

50

65

50

65

46  4
(39 – 56)

SPW

15

58 3
(51 – 65)

GUB

4

13  1
(11- 15)

GUW

B

8,7

C

47

D

51

E

48

430

SW

1,3

GS

0,67

11  1

14  1


56  5

(43 – 59)

(50 – 63)

75  5
(67 – 87)

1,3  0,1
(1,1 -1,50)

Muco

2,25

0,7  0,05
(0,64 -0,79)

V

55

2,4 0,56

55  2

(1,5 -3)

(50 – 58)

gai giao cấu, có dạng thuyền, phình rộng ở giữa và cong ở phần đầu. Khi quan
sát từ mặt bụng có thể thấy một cấu trúc dạng cái nêm dài, chẽ đôi nhưng
không kéo dài đến thân của gai giao cấu mà được tách biệt ở phần trước. Hệ
thống nhú sinh dục bao gồm: 1 nhú đơn trước huyệt sinh dục và 12 đôi nhú ở
phần đuôi, trong đó có 5 đôi nằm về phía bụng trước hậu môn, 1 đôi bên
ngang mức nhú đơn trước huyệt, 1 đôi nhú bụng gần hậu môn, 3 đôi đuôi phía
bụng bên và 1 đôi đuôi gần lưng. Đuôi hình chóp, tận cùng đuôi có 1 mucro
nhỏ. Plasmid không rõ.

22


Hình 3: Ảnh SEM con đực của Steinernema robustispiculum TN21
A: bề mặt đầu; B: Sắp xếp nhú sinh dục ở vùng đuôi; C: đuôi; D,E: gai đệm;
F: gai giao cấu. (Phan et al, 2004)
Con cái (thế hệ 1): cơ thể lớn và cong về phía bụng, tạo thành hình chữ
C khi xử lý nhiệt.Vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Phần đầu tròn rộng và không tách biệt với phần thân. Đỉnh đầu có 6 nhú
môi nhọn và 4 nhú đầu. Xoang miệng nông dạng phễu hoặc dạng cái cốc.
23


Cấu trúc thực quản và van thực quản điển hình. Nhánh sinh dục kép, gấp
khúc phần sau, bên trong tử cung chứa đầy trứng. Phần sau cơ thể hơi
phình rộng về phía sau hậu môn. Đuôi có cấu trúc vòm, tròn ,rộng. Chiều
dài của đuôi ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu môn. Tận cùng đuôi có một
cấu trúc như cái móc. Plasmid không rõ.

Hình 4: Ảnh SEM con cái và IJ của Steinernema robustispiculum TN21
A-C: con cái thế hệ thứ nhất: A: Bề mặt đỉnh đầu; B:vùng vulval; C: Đuôi. DF: Ấu trùng cảm nhiễm: D: đầu; E: Vỏ cutin và vùng bên ở phần giữa cơ thể;