BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DS. ĐOÀN THỊ TRANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ
SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT
TƯƠNG BẰNG GC-MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DS. ĐOÀN THỊ TRANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ
SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT
TƯƠNG BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Phần 1: TỔNG QUAN .......................................................................................................... 4
1.1.
THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT ................................................................. 4
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ..................................................................................................... 4
1.2.
THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ................................................. 5
1.2.1 Khái niệm và phân loại .............................................................................. 5
1.2.2 Tính chất, công thức của một số thuốc trừ sâu clor hữu cơ đặc trƣng. ...... 6
1.2.3 Đặc tính và cơ chế gây độc ...................................................................... 12
1.2.4 Dƣ lƣợng thuốc BVTV trong huyết tƣơng............................................... 13
1.3.
PHÂN TÍCH THUỐC BVTV TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG GCMS
15
1.3.1 Các kỹ thuật xử lý mẫu ............................................................................ 15
1.3.2 Sắc ký khí - khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectometry) ........ 17
1.3.3 Các yêu cầu, chỉ tiêu thẩm định phƣơng pháp GC-MS phân tích thuốc
BVTV trong huyết tƣơng. .................................................................................... 23
Phần 2 : ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT VIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 26
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU....................................................................... 26
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................... 26
2.2.1 Hóa chất, thuốc thử ..................................................................................... 26
2.2.2 Chất chuẩn ................................................................................................... 26
2.2.3 Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 27
2.3 . PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28
2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu ......................................................................... 28
2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp phân tích ............................................................ 28
2.3.2.1 Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ xác định thuốc BVTV. ........................ 28
2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................... 28
2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tƣơng ........................................... 29

4.4.VỀ DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG
HUYẾT TƢƠNG. ................................................................................................ 58
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 59
5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 59
5.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 61
PHỤ LỤC............................................................................................................................ 65


DDE

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association of Official
Analytical Chemists)
: Diclor diphenyl dicloretylen

DDD
DDT
HCH

: Diclor diphenyl dicloretan
: Diclor diphenyl tricloretan.
: Hexaclorocyclohexan

AOAC

ECD
EI

: Detector bắt điện tử (Electron capture detector)


SPE
TCVN
Thuốc BVTV

: Chiết pha rắn (Solid phase extraction)
: Tiêu chuẩn Việt Nam
: Thuốc bảo vệ thực vật


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
STT

Tên Bảng Biểu

Trang

1

Bảng 1 : Phân loại thuốc BVTV theo đối tƣợng sinh vật gây hại

4

2

Bảng 2 : Một số phƣơng pháp phân tích thuốc BVTV nhóm clor hữu
cơ trong huyết tƣơng.

21


Bảng 7: Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn CC-W.

43

8

Bảng 8: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tƣơng.

44

9

Bảng 9 : Tính thích hợp hệ thống GC-MS của α-HCH

44

10

Bảng 10: Độ lặp lại của hệ thống GC-MS

44

11

Bảng 11: Sự phụ thuộc giữa đáp ứng pic và nồng độ thuốc BVTV
nhóm clor hữu cơ trong huyết tƣơng.

47

12

17

2

Hình 2: Thiết bị GC-MS dùng trong phân tích

27

3

Hình 3: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 1.

32

4

Hình 4: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 2

32

5

Hình 5: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 3

33

6

Hình 6: Sắc ký đồ của hỗn hợp 18 chất theo chế độ quét SCAN


39

12

Hình 12: Sắc kí đồ mẫu huyết tƣơng khi chiết lỏng-lỏng

41

13

Hình 13: Sắc kí đồ mẫu huyết tƣơng khi chiết lỏng-lỏng và làm sạch
qua cột Florisil

41

14

Hình 14: Sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn

46

15

Hình 15: Đƣờng chuẩn phân tích thuốc BVTV trong huyết tƣơng

50

16

Hình 16: Sắc kí đồ của các thuốc BVTV ở nồng độ LOQ

tính dẫn đến tử vong hoặc làm biến đổi gen, gây nên các bệnh về di truyền ảnh
hƣởng đến nhiều thế hệ sau. Thuốc BVTV có nhiều cơ chế dẫn đến nguy cơ gây
ung thƣ. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, thuốc BVTV có khả năng gây ung thƣ

1


thông qua cơ chế mất cân bằng oxy hóa (oxidative stress) tạo ra nhiều phân tử có
gốc tự do có khả năng phá hủy cấu trúc DNA. Một số khác lại cho rằng thuốc
BVTV có khả năng hoạt động nhƣ những hormone khiến tế bào tăng trƣởng bất
thƣờng làm mất/giảm khả năng kiểm soát tăng sinh của tế bào [10]. Một số chất
gây ức chế (hoặc gây kích thích giả) đến tuyết nội tiết, gây mất cân bằng hoạt động
của các loại hooc-mon (hormone), từ đó gây ra các phản ứng tiêu cực đến hoạt động
bình thƣờng trong cơ thể và có thể là nguyên nhân gây ung thƣ vú.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu và
khả năng tăng nguy cơ ung thƣ vú trên đối tƣợng phụ nữ. Nghiên cứu của Cohn và
cộng sự chỉ ra rằng việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu DTT (dichloro diphenyl
trichlorothane) trƣớc thời kỳ dậy thì có nguy cơ ung thƣ vú cao hơn rất nhiều so với
việc phơi nhiễm thuốc trừ sâu sau lứa tuổi dậy thì [13]. Nghiên cứu trên đối tƣợng
những ngƣời vợ của ngƣời nông dân bị phơi nhiễm với thuốc trừ sâu tại Iowa và
miền bắc Carolina, Mỹ từ năm 1993-2000 chỉ ra rằng những ngƣời vợ của nông dân
sử dụng thuốc BVTV có nguy cơ mắc ung thƣ vú cao hơn so với những ngƣời
không sử dụng thuốc BVTV [20].
Hiện nay, ung thƣ vú là ung thƣ có tỷ lệ cao nhất trên phụ nữ ở Hà Nội, và ung
thƣ vú ngày càng có xu hƣớng trẻ hóa, chứng tỏ sự thay đổi lối sống và ô nhiễm
môi trƣờng ở Việt Nam là một trong những nguyên nhân liên quan đến sự gia tăng
và trẻ hóa của bệnh [24]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, 75-80% ung thƣ phát sinh
do tác động của môi trƣờng và lối sống, trong khi đó gen di truyền chỉ chiếm 2025% [9] [28].
Việt Nam là một trong những nƣớc có nền nông nghiệp phát triển lâu đời với
nhiều mặt hàng nông sản. Để đạt năng suất cao trong nông nghiệp việc sử dụng

1.1.

THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

1.1.1. Khái niệm
Thuốc BVTV là những hợp chất hoá học (vô cơ, hữu cơ), những chế phẩm
sinh học (chất kháng sinh, vi khuẩn, nấm, siêu vi trùng, tuyến trùng, …), những chất
có nguồn gốc thực vật, động vật, đƣợc sử dụng để bảo vệ cây trồng và nông sản,
chống lại sự phá hại của những sinh vật gây hại (côn trùng, nhện, tuyến trùng,
chuột, chim, thú rừng, nấm, vi khuẩn, rong rêu, cỏ dại, …)
Theo qui định tại điều 1, chƣơng 1, điều lệ quản lý thuốc BVTV (ban hành
kèm theo Nghị định số 58/2002/NĐ-CP ngày 03/6/2002 của Chính phủ), ngoài tác
dụng phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật, thuốc BVTV còn bao gồm cả
những chế phẩm có tác dụng điều hoà sinh trƣởng thực vật, các chất làm rụng lá,
làm khô cây, giúp cho việc thu hoạch mùa màng bằng cơ giới đƣợc thuận tiện (thu
hoạch bông vải, khoai tây bằng máy móc, …) và những chế phẩm có tác dụng xua
đuổi hoặc thu hút các loài sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt.
1.1.2. Phân loại
Để thuận tiện trong quá trình sử dụng cũng nhƣ công tác quản lý, thuốc BVTV
thƣờng đƣợc phân loại thành các nhóm khác nhau theo mục đích sử dụng, tác dụng,
nhóm hoạt chất, thành phần nguyên tố hay độc tính…Thông thƣờng, chúng ta chỉ
quan tâm đến tác dụng và thành phần nguyên tố hay nhóm hoạt chất trong thuốc trừ
sâu [4].
Phân loại dựa trên đối tƣợng sinh vật gây hại:
Bảng 1: Phân loại thuốc BVTV theo đối tƣợng sinh vật gây hại
Thuốc trừ bệnh Thuốc trừ nhện
Thuốc trừ sâu

Thuốc trừ tuyến trùng


1.2.

THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ

1.2.1 Khái niệm và phân loại

5


Thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ đƣợc hình thành khi
thay thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon
bằng các nguyên tử clor. Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen
hoặc dị vòng (chứa dị tố O, N, hay S). Các chất này thƣờng là các dẫn xuất clor của
một số hợp chất hữu cơ nhƣ diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [1]
Về mặt cấu tạo, thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ đƣợc xếp vào 4 nhóm nhỏ
[30]:
-

Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…

-

Nhóm

hợp

chất

benzen:


HCH, còn lại các đồng phân khác [2],[4].
- Đồng phân γ của HCH còn đƣợc gọi là Lindane đƣợc sử dụng để chống côn
trùng và ong trong trồng cây ăn trái, nông nghiệp, và lâm nghiệp. Trong môi trƣờng,
Lindane có thể bị phân hủy dần bởi các vi sinh vật có trong đất ở cả hai điều kiện
hiếu khí và kỵ khí tạo thành các dẫn xuất clo của benzen và phenol. Lindane biến
thành đồng phân α khi tiếp xúc với ánh sáng có bƣớc sóng trên 230 nm. Con ngƣời
có thể tiếp xúc thuốc trừ sâu này từ nƣớc uống bị ô nhiễm hoặc ăn các sản phẩm
thực phẩm từ cá hay động vật bị nhiễm. Lindane cũng có thể tích tụ trong các mô
mỡ ở ngƣời và động vật. Nó cũng đƣợc phát hiện trong sữa mẹ [15]. Lindane bị
cấm ở Hoa Kỳ và hầu hết các nƣớc châu Âu.
Khi đun nóng để phân hủy, HCH phát ra các khí độc nhƣ khí clo, hydroclorua
và phosgene. HCH rất bền vững trong điều kiện bình thƣờng, bền với tác động của
ánh sáng, chất oxy hóa, môi trƣờng acid nhƣng bị phân hủy trong môi trƣờng kiềm.
Con đƣờng phân huỷ chung nhất của HCH là sự thơm hoá cho các clobenzen
khác nhau và những dẫn xuất của chúng (chủ yếu là các dẫn xuất hydroxy). Sản
phẩm đầu tiên của sự chuyển hoá của HCH ở hầu hết các loài là sự khử clor cho γ1,3,4,5,6 pentaclocyclohexen (γ-PCCH)
Aldrin
Công thức phân tử : C12H8Cl6
Công thức cấu tạo:

Tên

gọi

(IUPAC):

1,2,3,4,10,10-Hexachloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahydro

1,4:5,8dimethanonaphthalene.


khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt. Vì độc tính cao và tác hại đối với sức khỏe con
ngƣời, việc sử dụng và bán thuốc trừ sâu này đã bị cấm ở Hoa Kỳ vào năm 1986.
Diendrin
Công thức phân tử: C12H8Cl6O.

Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: (1a R , 2 R , 2a S , 3 S , 6 R , 6a R , 7 S , 7a S) -3,4,5,6,9,9hexachloro-1a, 2,2a, 3,6, 6a, 7,7a-octahydro-2,7: 3,6-dimethanonaphtho [2,3- b ]
oxirene.
Diendrin là thuốc BVTV đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp trên toàn
thế giới. Hiện nay, Diendrin đã bị cấm sử dụng do độc tính cao và tính bền vững
trong môi trƣờng.
Endosulfan, Endosulfal sulfat
Công thức phân tử của Endosulfan: C9H6Cl6O3S.

9


Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: 6,7,8,9,10,10-Hexachloro-1,5,5a, 6,9,9a-hexahydro- 6,9methano-2,4,3-benzodioxathiepine-3-oxit.
Công thức phân tử của Endosulfan sulfat: C9H6Cl6O4S.

Công thức cấu tạo:

Endosulfan là một thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ gồm hai đồng phân endo
và exo, đƣợc gọi là Endosulfan I và Endosulfan II. Endosulfan sulfate là một sản
phẩm của quá trình oxy hóa chứa thêm một nguyên tử O gắn với nguyên tử
S. Endosulfan đã trở thành một hóa chất gây tranh cãi cao do độc tính cấp tính của
nó, khả năng gây tích lũy trong cơ thể, và vai trò nhƣ một chất gây rối loạn nội tiết.


11


Các đồng phân của DDT và chất chuyển hóa

Methoxyclor
Công thức phân tử: C16H15Cl3O 2
Công thức cấu tạo:

Tên gọi IUPAC: 1,1,1-Trichloro-2,2-bis (4-methoxyphenyl) etan.
Methoxyclor là một hợp chất có cấu trúc hóa học tƣơng tự nhƣ DDT đƣợc
dùng để thay thế DDT sau lệnh cấm. Nó ít độc hơn DDT và giảm nhanh hơn trong
môi trƣờng. Methoxyclor đƣợc dùng để kiểm soát côn trùng và các ký sinh trùng.
Việc sử dụng methoxyclor nhƣ thuốc trừ sâu đã bị cấm tại Hoa Kỳ vào năm
2003 và ở Liên minh châu Âu vào năm 2002.
1.2.3 Đặc tính và cơ chế gây độc
Các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an
toàn với cây trồng ở liều thông dụng nhƣng lại độc với các loài động vật máu nóng.
Các chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất
bền trong môi trƣờng, hiệu lực tồn dƣ lâu dài [5][15]. Vì vây hầu hết các loại thuốc
này rất độc và bị cấm sử dụng nhiều nƣớc trên thế giới ví dụ nhƣ DDT,Aldrin…Ở

12


Việt Nam, các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ vẫn còn đƣợc sử dụng ở mức độ hạn
chế nhƣ Dicofor, Endosulfan... Phần lớn thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ khó phân
hủy nên chúng vẫn tồn tại trong môi trƣờng, đất canh tác, nguồn nƣớc. Do vậy,
chúng có thể thông qua thức ăn, nƣớc uống nhiễm vào cơ thể ngƣời.

nhất vì tính khả thi cao. Hơn nữa, nồng độ các chất độc hại trong máu tại một
khoảng thời gian cụ thể sau khi phơi nhiễm sẽ vẫn nhƣ nhau nếu nhƣ lƣợng hấp thụ
là không thay đổi; do không có sự điều chỉnh để pha loãng nên không ảnh hƣởng
đến nồng độ chất phơi nhiễm [32]. Dƣới đây là một số nghiên cứu trên thế giới về
xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong các mẫu máu:
Một nghiên cứu từ Ontario - Canada, trong đó kết hợp nghiên cứu các mô mỡ
và mẫu máu khi khám nghiệm tử thi các nạn nhân tai nạn ở Norfolk và 52 mẫu máu
từ những ngƣời tham gia vào việc sử dụng DDT trong nông nghiệp ở Canada và
315 mẫu máu của ngƣời dân ở Hà Lan đƣợc phân tích dƣ lƣợng DDT. Kết quả thu
đƣợc giá trị trung bình dƣ lƣợng DDT trong mô mỡ và trong máu tƣơng ứng là 5,83
và 0,032 ppm, kết quả có sự tƣơng quan có ý nghĩa thống kê giữa lƣợng DDT trong
mô mỡ và máu. Giá trị trung bình của DDT trong máu của các nạn nhân ở Norfolk
là 0,032ppm, của ngƣời dân ở Hà Lan là 0,016 ppm, của 26 ngƣời bị phơi nhiễm
trong quá trình sử dụng DDT trong nông nghiệp là 0,063 ppm [11].
Trong một nghiên cứu, có 41 mẫu máu mẹ, sữa, mỡ dƣới da và máu dây rốn
đƣợc phân tích từ các bà mẹ sinh con bằng phẫu thuật mổ lấy thai tại Bệnh viện
quốc gia Kenyatta ở Nairobi năm 1986. Các thuốc BVTV chính đƣợc tìm thấy trong
tất cả các mẫu phân tích là pp '-DDT (100%), pp' DDE (100%), op 'DDT (59%),
dieldrin (27%), transnonachlor (15%), β- HCH (12%) và lindane (2%). Mức trung
bình (mg/kg mỡ) của t-DDT là 5,9 ở mỡ dƣới da, 4,86 trong sữa mẹ, 2,75 trong
huyết thanh mẹ và 1,9 trong huyết thanh rốn. Mức trung bình của betahexachlorocyclohexane (β- HCH) trong mỡ dƣới da và chất béo của sữa tƣơng ứng
là 0,034 và 0,26 mg/kg mỡ [18].
Mẫu máu của 135 cƣ dân sống gần cửa sông Elb (Schleswig-Holstein, Đức) đã
đƣợc tìm thấy các thuốc BVTV nhóm clor hữu cơ (ví dụ: β- HCH: 0,5-22,9 ng/ml),

14


benzen


DDD, pp 'DDT và t-DDT với giá trị trung bình lần lƣợt là 20,85, 1,15, 2,03, 9,28 và
32,61 μg/l. Nồng độ α, β và γ - và t-HCH trong huyết thanh là 4,49, 35,06, 1,69 μg/l
và 41,23 μg/l tƣơng ứng. Hexachlorobenzene đã có mặt trong 7 mẫu ở nồng độ
trung bình 0,2 μg/l [12].
1.3.

PHÂN TÍCH THUỐC BVTV TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG GCMS

1.3.1 Các kỹ thuật xử lý mẫu
a) Chiết lỏng - lỏng:
Chiết lỏng - lỏng là phƣơng pháp chuyển chất phân tích hòa tan từ dung môi
này sang một dung môi không đồng tan khác. Trong thực tế, thƣờng đƣợc sử dụng
hai pha Nƣớc - Dung môi hữu cơ để chiết tách. Trong kỹ thuật chiết lỏng - lỏng, yếu
tố cần quan tâm nhất là độ phân cực của dung môi phải phù hợp với chất phân tích.

15


Khi cần thiết phải phối hợp các loại dung môi khác nhau để thay đổi độ phân cực,
độ nhớt, lực dung môi.
Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật đơn giản, hiệu quả và khá ổn định. Tuy nhiên, kỹ
thuật này có nhƣợc điểm là sử dụng nhiều dung môi, gây ảnh hƣởng đến môi
trƣờng, một số dung môi độc hại còn có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời làm.
Bên cạnh đó, trong quá trình làm còn có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch kết quả.
b) Chiết pha rắn (SPE):
Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha lỏng và
rắn, trong đó chất phân tích đƣợc chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau đó rửa giải bằng
dung môi thích hợp. Chiết pha rắn là kỹ thuật khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của
chiết lỏng – lỏng. Lƣợng dung môi sử dụng ít, dịch chiết dễ xử lý khi kết nối GC,
HPLC, khả năng làm sạch và làm giàu mẫu tốt. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhƣợc

Sắc ký khí khối phổ là một trong những phƣơng pháp sắc ký hiện đại với
độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết
hợp. Thiết bị GC-MS bao gồm 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tách
chất cần phân tích ra khỏi hỗn hợp, phần khối phổ (MS) để cung cấp thông tin về tỉ
số khối lƣợng/điện tích của chất phân tích . Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này chúng
ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lƣợng.
 Sắc ký khí:

Hình 1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống GC
Sắc ký khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, ứng dụng tốt đối với
những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt. Pha động trong GC là chất khí (thƣờng sử
dụng các khí trơ nhƣ He, Ar, N2…). Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ
trên một chất mang rắn trơ. Chất phân tích đƣợc pha động đƣa vào cột dƣới dạng

17