TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

PHẠM KHÁNH NGỌC

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN
KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

PHẠM KHÁNH NGỌC

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN
KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY

Cuối cùng, cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, yêu thương,
tạo điều kiện cho con hoàn thành luận văn cũng như chương trình học
của mình. Cảm ơn tập thể Hóa dược 1 K38 đặc biệt là những người bạn
đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn!

i


Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
2. Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
(LC/MS/MS)
3. Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477
Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

2. Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
(LC/MS/MS)
3. Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477
Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện 1

Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi

iii


..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện 2

Ths. Dương Thị Phương Liên

iv


TÓM TẮT
Vitamin D3 là một trong các loại vitamin thiết yếu, có vai trò đặc biệt
quan trọng đối với sức khỏe xương. Ngày nay, rất nhiều các sản phẩm dinh
dưỡng được bổ sung vitamin D3 để cung cấp đủ lượng cần thiết cho cơ thể con
người mà thông dụng nhất là các loại sữa. Tuy nhiên việc nghiên cứu phương
pháp xác định hàm lượng vitamin D3 trong các loại sữa này chưa được làm
nhiều. Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D3
trong các loại sữa bột nhằm đánh giá đúng chất lượng của các sản phẩm này.
Sau khi tham khảo, thử nghiệm nhiều nghiên cứu, đề tài đã lựa chọn quy
trình sử dụng phương pháp xà phòng hóa, chiết lỏng-lỏng để trích ly mẫu và
phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ LC/MS/MS để phân tích định
lượng. Tiến hành đánh giá phương pháp thông qua một số các chỉ tiêu thẩm
định cơ bản, kết quả đều phù hợp các tiêu chuẩn phân tích. Đề tài phân tích
hàm lượng vitamin D3 trên 20 mẫu thực, kết quả cho thấy 100% các mẫu đều
có chứa vitamin D3, hàm lượng trung bình là 76,89 ppb, mặc dù vẫn có sự
chênh lệch giữa hàm lượng phân tích được với thông tin có trên bao bì sản
phẩm nhưng sự chênh lệch này là không quá lớn. Điều này chứng tỏ phương
pháp phân tích có độ chính xác tương đối, có thể được áp dụng vào trong

1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Tổng quan về vitamin ......................................................................... 3
2.1.1 Khái niệm ................................................................................ 3
2.1.2 Đặc điểm ................................................................................. 3
2.1.3 Phân loại .................................................................................. 3
2.1.4 Vai trò ...................................................................................... 4
2.2 Tổng quan về vitamin D ..................................................................... 5
2.2.1 Lịch sử phát hiện ..................................................................... 6
2.2.2 Phân loại .................................................................................. 6
2.3 Tổng quan về vitamin D3 .................................................................... 8
2.3.1 Đặc điểm ................................................................................. 8
2.3.2 Tính chất.................................................................................. 9
2.3.3 Hấp thu và chuyển hóa .......................................................... 10
2.3.4 Vai trò sinh lý ........................................................................ 12
vii


2.3.5 Nhu cầu ................................................................................. 14
2.3.6 Nguồn cung cấp..................................................................... 15
2.3.7 Ứng dụng ............................................................................... 16
2.4 Tổng quan về các phương pháp chuẩn bị mẫu ................................. 17
2.4.1 Phương pháp xà phòng hóa ................................................... 17
2.4.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng ................................................ 18
2.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS) ........ 19
2.5.1 Tổng quan về LC/MS/MS ..................................................... 19
2.5.2 Cấu tạo hệ thống LC/MS/MS ................................................ 20
2.5.3 Nguyên tắc hoạt động............................................................ 27
2.5.4 Một số kỹ thuật quét khối phổ MS/MS ................................. 27

4.8 Độ chệch ........................................................................................... 53

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 55
5.1 Kết luận ............................................................................................. 55
5.2 Kiến nghị ........................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 57
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 59

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Phân loại các vitamin theo khả năng hòa tan ..................................... 4
Bảng 2.2 Vai trò của một số vitamin................................................................. 5
Bảng 2.3 Nhu cầu vitamin D3 được khuyến nghị trong khẩu phần dinh dưỡng
hằng ngày do Viện Dinh Dưỡng đề nghị năm 2008. ....................................... 14
Bảng 2.4 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin D3 ........................................... 15
Bảng 3.1 Thông tin của các loại sữa bột được sử dụng trong đề tài ............... 37
Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ..... 43
Bảng 3.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
......................................................................................................................... 44
Bảng 4.1 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitamin D3 46
Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi của Vitamin D3 .................................................... 50
Bảng 4.3 Độ lặp lại của phương pháp ............................................................. 50
Bảng 4.4 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D3 trên các mẫu sữa ............ 52
Bảng 4.5 Độ chệch của phương pháp.............................................................. 53

x



◦

C

Độ Celcius

µL

microliters

AAS

Atomic Emission Spectroscopy

AES

Atomic Absorption Spectroscopy

AOAC

Association Of Analytical Communities

DC

Direct Current

ESI

ElectroSpray Ionization


parts per billion

ppm

parts per million

PTN

Phòng Thí Nghiệm

RP

Reversed Phase

SPE

Solid Phase Extraction

SPME

Solid Phase Micro Extraction

USFDA

United States Food and Drug Administration

USP

United States Pharmacopeia


D mà chủ yếu là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do ít tiếp xúc với ánh nắng
mặt trời, do rối loạn chuyển hóa hay do nhu cầu cao ở phụ nữ có thai và cho
con bú…
Mặt khác, việc dùng vitamin D quá liều sẽ gây ngộ độc thuốc, làm tăng
calci trong máu, dẫn đến các biểu hiện: mệt mỏi, chán ăn, nôn, tiêu chảy, đau
nhức xương khớp… hơn nữa còn có thể gây tổn thương thận và tăng huyết áp.
Do đó, việc cung cấp cho cơ thể một lượng vitamin D vừa đủ và đều đặn mỗi
ngày là một việc làm rất cần thiết.
Vitamin D3 là dạng vitamin D chủ yếu mà cơ thể con người hấp thu và
chuyển hóa. Có hai nguồn tiếp nhận vitamin D3, đó là tổng hợp ở da dưới tác
dụng của bức xạ tia cực tím trong ánh sáng mặt trời và từ các loại thực phẩm
1


như dầu cá, gan động vật, lòng đỏ trứng gà, sữa… Tuy nhiên, thực phẩm hằng
ngày thường không cung cấp đủ lượng vitamin D3 cần thiết cho cơ thể, do đó
người ta sử dụng thêm các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung mà chủ yếu là
các loại sữa.
Chính vì thế, việc tìm hiểu, nghiên cứu các phương pháp để xác định
hàm lượng vitamin D3 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung là hết sức
cần thiết. Trên thế giới, nhiều nhà phân tích hóa học đã có nhiều công trình
nghiên cứu về vấn đề trên. Các phương pháp khác nhau đã được áp dụng để
xác định hàm lượng vitamin D3 trong thực phẩm như LC, HPLC, LC/MS,
LC/MS/MS... Trong số các phương pháp nêu trên, LC/MS/MS được xem là
một trong những phương pháp đơn giản, có tính ưu việt, tính chọn lọc cũng
như có độ nhạy, độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp thích hợp để phân
tích vi lượng.
Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều loại sản phẩm sữa được
bổ sung thêm vitamin D3 với hàm lượng khác nhau nhưng việc nghiên cứu về
chúng chưa được tiến hành nhiều. Vì vậy, dựa vào tài liệu tham khảo kết hợp


Đánh giá quy trình phân tích.

-

Định lượng vitamin D3 trong một số sản phẩm sữa bổ sung dạng bột
trên thị trường TP Cần thơ
2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về vitamin [1-9]
2.1.1 Khái niệm
Vitamin là những hợp chất hữu cơ mà tế bào con người và động vật
không thể tự tổng hợp được (trừ vitamin D), có mặt trong thức ăn với hàm
lượng rất nhỏ, cấu trúc hoàn toàn khác với glucid, protid và lipid nhưng rất cần
thiết cho một số phản ứng chuyển hóa giúp duy trì sự phát triển và sự sống
bình thường, khi thiếu hụt sẽ gây nên các bệnh lý đặc hiệu.
2.1.2 Đặc điểm
Mặc dù có cấu trúc, vai trò và cơ chế hoạt động khác nhau nhưng tất cả
các vitamin đều có những đặc tính cơ bản như sau:
Vitamin không phải là những chất cung cấp năng lượng cũng như
thành phần cấu trúc của cơ thể mà chúng tham gia vào những hệ enzyme,
xúc tác cho các phản ứng sinh học, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
sản xuất và sử dụng năng lượng. Cơ thể chỉ có thể sử dụng hiệu quả
nguồn nguyên liệu cung cấp năng lượng (lipid, protid, hydrocarbon và
nước) nếu duy trì được nồng độ tối ưu của các chất xúc tác này.
Khác với enzyme và hormone, cơ thể con người và gia súc không
thể hoặc có rất ít khả năng tự tổng hợp được vitamin, vitamin hàng ngày

Vitamin B2
(Riboflavin)

Vitamin B15 (Pangamic
acid)

Vitamin B3
(Pantothenic acid)

Vitamin C (Ascorbic acid)

Vitamin D
Vitamin E
Vitamin K

Vitamin B5/ PP
(Niacinamide)

Vitamin H (paminobenzoic acid)
Vitamin I (inositol)

Vitamin B6
(Pyridoxine)

Vitamin P (Flavonoids)

Vitamin B7 (Biotin)

Vitamin U (S-methylmethionine)


K

Điều tiết sự biến đổi protein trong quá trình đông máu

B1

Chuyển aldehyde, loại carboxyl trong quá trình lên men rượu
và chu trình acid citric

B2

Phản ứng oxy hóa khử, đặc biệt trong chu trình acid citric và
4


vận chuyển điện tử
B5

Phản ứng oxy hóa khử ở nhiều con đường chuyển hóa

B6

Phản ứng chuyển nhóm amino, đặc biệt ở các acid amin

B7

Phản ứng carboxyl hóa trong chuyển hóa carbohydrate và lipid

Bc



K

Các rối loạn về đông máu

B1

Bệnh tê phù, bệnh viêm thần kinh

B2

Viêm giác mạc, viêm da

B5

Triệu chứng Burning-Feet, viêm mũi – miệng

B6

Bệnh động kinh, viêm da, môi, lưỡi

Bc

Hồng cầu khổng lồ, thiếu máu

B3

Bệnh thiếu vitamin PP (pellagra)

B12

Năm 1928, Windaus – nhà hóa học người Đức nhận giải Nobel Hóa Học
vì đã phân lập được vitamin D từ nguồn thực vật và động vật là dầu cá ngừ.
2.2.2 Phân loại
Vitamin D tồn tại ở nhiều dạng (vitamer) khác nhau. Chúng bao gồm
vitamin D1, vitamin D2, vitamin D3, vitamin D4, vitamin D5… Trong đó hai
dạng chính là vitamin D2 (còn gọi là ergocalciferol) và vitamin D3
(cholecalciferol). Vitamin D được viết không kèm theo chỉ số được hiểu là D2
hoặc D3 hoặc cả hai, chúng được gọi chung là calciferol. Cấu trúc hóa học của
vitamin D2 được xác định lần đầu vào năm 1931. Vào năm 1935, cấu trúc hóa
học của vitamin D3 được xác định và chứng minh là nó được tạo thành từ quá
trình biến đổi của 7-dehydrocholesterol dưới tác động của tia cực tím.
Trong hóa học, các dạng khác nhau của vitamin D là những secosteroid –
steroid bị gãy một trong những liên kết trong các vòng steroid.

6


Hình 2.1 Bảng phân loại các dạng vitamin D
Sự khác biệt về cấu trúc của vitamin D2 và vitamin D3 nằm ở các chuỗi
bên của chúng. Chuỗi bên của vitamin D2 chứa một liên kết đôi giữa carbon
22 và 23 và một nhóm methyl trên carbon 24.

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử vitamin D2 và vitamin D3
Vitamin D2 là một dẫn xuất của ergosterol, một sterol có trong màng tế
bào của nấm cựa gà. Sterol này cũng có trong một số loài thực vật phù
du, động vật không xương sống, nấm men, và nấm lớn. Vitamin D2 được sản
7


xuất từ ergosterol trong cơ thể của các sinh vật này, dưới sự tác kích của tia

Vitamin D3 được xem như một hormone vì nó được tổng hợp ở dưới da
đi vào máu đến cơ quan đích tạo nên tác dụng thông qua receptor đặc hiệu.
Hoạt tính enzyme hydroxylase xúc tác cho quá trình chuyển hóa vitamin D3
thành chất có hoạt tính được điều hòa theo cơ chế điều khiển ngược thông qua
nồng độ ion calci trong máu.
2.3.2 Tính chất
2.3.2.1 Tính chất vật lý
Vitamin D3 không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như
petrolium ether, alcohol, methanol, chloroform…
Là tinh thể hình kim, màu trắng. Không mùi.
Nhiệt độ nóng chảy ở 83 - 86◦C, nhiệt độ sôi 496,4◦C.
Vitamin D3 khá bền với nhiệt, môi trường acid (hữu cơ), kiềm và các tác
nhân khử.
Đơn vị: IU, 1 IU = 0,025 µg vitamin D3.
Bị hấp thụ cực đại (trong alcohol hay hexane) ở bước sóng 264,5 nm.
2.3.2.2 Tính chất hóa học
Tên IUPAC: (3β,5Z,7E)-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol.
Công thức phân tử: C27 H44 O
Công thức cấu tạo:

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của cholecalciferol (vitamin D3)
Khối lượng phân tử: 384,64 g/mol.
Được tổng hợp từ provitamin 7-dehydrocholesterol có sẵn trong da người
và động vật dưới tác dụng của tia cực tím có bước sóng từ: 270- 290 nm.
9


Hình 2.5 Phản ứng tổng hợp vitamin D3
Vitamin D3 rất nhạy cảm với ánh sáng, dưới tác dụng của bức xạ tia UV:
Cholecalciferol ↔ sura-sterols → ergosterol

phản ứng dị hóa tại các mô đích.

Hình 2.7 Các phản ứng chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể
Vitamin D3 được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, mật rất cần thiết cho sự
hấp thụ ở ruột non.
Vì vitamin D3 tan trong lipid nên được tập trung trong vi thể dưỡng chấp
và được hấp thu theo hệ bạch huyết, trong máu chúng liên kết với alpha
glubomin đặc hiệu. Thời gian bán hủy trong huyết tương là 19-25 giờ nhưng
lại được lưu trữ lâu dài trong các mô mỡ.

11