TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------

TÔN PHÚ TÙNG

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY

2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------

TÔN PHÚ TÙNG

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC

Chân thành cảm ơn!
TÔN PHÚ TÙNG

Luận văn Đại Học

iii

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

------

------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
2. Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC
ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học

------

------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện:……………………………………………………………..
2. Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC
ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
ĐẦU DÒ UV-VIS”.
3. Sinh viên thực hiện: Tôn Phú Tùng MSSV: B1304130 Lớp: Hóa HọcKhóa: 39
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
................................................................................................................................
……........................................................................................................................

phổ biến nhất.
Tuy nhiên, quy trình phân tích này còn nhiều mặt hạn chế và chưa thống
nhất về nhiều mặt. Từ thực tế đó, việc thẩm định các tiêu chí như tính tuyến tính,
giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ đúng làm tăng độ tin cậy
và tính thống nhất của quy trình định lượng.
Kết quả thực hiện thẩm định cho quy trình đảm bảo độ tin cậy cao với tính
tuyến trong khoảng 25-200 mg/L. Độ đúng đạt trong khoảng 94-106%. Độ chính
xác với RSD < 2%. Giới hạn phát hiện là 0,000355 mg/L, giới hạn định lượng là
0.010764 mg/L.
Ứng dụng quy trình để thực hiện xác định hàm lượng Gibberellic acid có
trong 3 mẫu nông dược đang được lưu hành trên thị trường. Trong đó, có 2 mẫu
đạt yêu cầu và một mẫu không đạt yêu cầu so với hàm lượng trên nhãn.
Từ quy trình định lượng Gibberellic acid bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS có thể kiến nghị để ứng dụng để thực hiện xác
định dư lượng Gibberellic acid có trong nông sản, đảm bảo tính an toàn của
nông sản và sức khỏe người tiêu dùng.
Từ khóa: Gibberellic acid, quy trình định lượng, HPLC/UV-VIS, sắc ký
lỏng hiệu năng cao, quang phổ,…

Luận văn Đại Học

vi

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
LỜI CAM KẾT
Tôi tên Tôn Phú Tùng, tôi xin cam đoan những số liệu sử dụng trong luận
văn này hoàn toàn là nghiên cứu của riêng tôi và chưa từng được sử dụng trong

1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN............................................................................... 3
2.1 Tổng quan về quang phổ ................................................................................................... 3
2.1.1 Sơ lược về sự ra đời và lịch sử nghiên cứu quang phổ .............................................. 3
2.1.2 Định luật hấp thu ........................................................................................................ 5
2.1.3 Các yếu tố liên quan đến sự hấp thu .......................................................................... 5
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu ........................................................................ 7
2.1.5 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp trắc quang ................................................. 8
2.1.6 Cấu tạo máy quang phổ UV-VIS ............................................................................. 10
2.2 Tổng quan về HPLC ....................................................................................................... 12
2.2.1 Nguyên tắc ............................................................................................................... 12
2.2.2 Các bộ phận cơ bản của máy HPLC ........................................................................ 13
2.2.3 Một số đại lượng đặc trưng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................... 15
2.3 Tổng quan về Gibberellic acid ........................................................................................ 19
2.3.1 Sơ lược về lịch sử phát hiện Gibberellic acid .......................................................... 19
2.3.2 Cấu tạo, danh pháp, tính chất ................................................................................... 19
2.3.3 Tính chất sinh lý của Gibberellic acid...................................................................... 20
2.3.4 Độc tính.................................................................................................................... 21
2.3.5 Tổng quan về định lượng Gibberellic acid............................................................... 22
2.4 Tổng quan về thẩm định quy trình định lượng Gibberallic acid bằng HPLC/UV-VIS .. 22
2.4.1 Định nghĩa ................................................................................................................ 22
2.4.2 Mục đích .................................................................................................................. 22
2.4.3 Các chỉ tiêu thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 23

CHƯƠNG 3 . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 29
Luận văn Đại Học

viii


2.11.4 Độ lặp lại ................................................................................................................ 38
2.12 Định lượng trên mẫu thật .............................................................................................. 41
2.12.1 Phân tích chuẩn Gibberellic acid............................................................................ 41
2.12.2 Phân tích các mẫu trên thị trường .......................................................................... 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 47
2.13 Kết luận ......................................................................................................................... 47
2.14 Kiến nghị....................................................................................................................... 47

Luận văn Đại Học

ix

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Tổ hợp màu và màu bổ sung .................................................................5
Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận được các nồng độ khác nhau (AOAC) ...24
Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận được ở các nồng độ khác nhau ........................25
Bảng 3.1 Hàm lượng đăng ký các mẫu thu gom trên thị trường ........................31
Bảng 4.1 Cách chuẩn bị dung dịch Gibberellic acid ..........................................35
Bảng 4.2 Kết quả hấp thu ABS của GA3 ở bước sóng 206 nm ..........................35
Bảng 4.3 Kết quả tính LOD và LOQ .................................................................36
Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi .................................................................................38

Luận văn Đại Học


Hình 4.8 Sơ đồ các bước pha dung dịch mẫu ....................................................43
Hình 4.9 Kết quả phân tích mẫu Gibber 4T (4%) ..............................................44
Hình 4.10 Kết quả phân tích mẫu Gibber 1T (1%) ............................................45
Hình 4.11 Kết quả phân tích mẫu Gibber 20T (20%) ........................................46

Luận văn Đại Học

xi

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
DANH SÁCH PHỤC LỤC
Bảng PHỤC LỤC A Mức độ sai lệch cho phép của hàm lượng hoạt chất .......52

Luận văn Đại Học

xii

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
HPLC

High Performance Liquid Chromatography


Mass Spectrometry

Luận văn Đại Học

xiii

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, các loại nông dược có chứa thuốc kích thích sinh trưởng nói
chung và Gibberellic acid nói riêng được nhà nông sử dụng rộng rãi để tăng năng
suất nông sản. Gibberellic acid có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh ở cây
trồng, làm tăng ưu thế chồi, ảnh hưởng đến sự tạo thành hạt, sự nảy mầm của hạt.
Bên cạnh đó, việc sử dụng lâu dài các loại nông sản có chứa dư lượng lớn
Gibberellic acid sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng.
Các loại thuốc chứa Gibberellic acid được cấp số đăng ký ngày càng nhiều.
Bên cạnh đó các loại thuốc kém chất lượng, với hàm lượng sai khác so với hàm
lượng in trên nhãn và chưa được đăng ký cấp phép vẫn được lưu hành rãi do giá
thành thấp và sự hiểu biết còn hạn chế của nông dân về nông dược. Các loại thuốc
giả, thuốc kém chất lượng không những gây nên thiệt thòi cho người nông dân
mà còn ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. Vì thế, phương pháp
kiểm nghiệm định lượng các loại thuốc bảo vệ thực vật có chứa Gibberellic acid
là cần thiết đối với các nhà sản xuất, các nhà nghiên cứu và các cơ quan quản lý
chất lượng thuốc.
Trong những năm qua, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò
UV-VIS (HPLC/UV-VIS) của Cục Bảo vệ Thực vật (thuộc Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn) được các nhà sản xuất để kiểm nghiệm hàm lượng


Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid bằng phương pháp
HPLC/UV-VIS theo các tiêu chí khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện,
giới hạn định lượng, độ đúng và độ lặp lại.
Xác định hàm lượng Gibberellic acid có trong một số mẫu nông dược được
sử dụng trong giai đoạn hiện nay.

Luận văn Đại Học

2

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về quang phổ
2.1.1 Sơ lược về sự ra đời và lịch sử nghiên cứu quang phổ
Cách đây 200 năm, Joseh von Fraunhofer (1787-1826) lần đầu tiên sản xuất
loại máy đo quang phổ mà tính năng không có gì sánh kịp lúc bấy giờ. Ông có
thể xác định chính xác độ dài bước sóng của nhiều vạch. Tuy nhiên, trong thời
gian này ông ấy không hiểu được những cơ sở vật lý về những vấn đề mà ông ấy
đã khám phá ra.
Vào năm 1859 với sự cộng tác của nhiều nhà vật lý nổi tiếng như Gustav R.
Kirchhoff, Robert W Bunsen tại Heidelberg. Họ đã sử dụng thiết bị có tên là
“Spektralapparat”, họ đã ghi nhận được quá trình phát xạ rất đặc biệt của nhiều
nguyên tố khác nhau. Với phương pháp này họ đã tiếp tục khám phá ra hai nguyên
tố mới là casium và rubidium. Sự khám phá này là nền tảng cho sự khám phá tiếp
theo về sự hấp thu và phát xạ của hấp thu phân tử.


bước sóng từ 396-760 nm. Vùng ngay trước và sau vùng khả kiến được gọi là
vùng tử ngoại và vùng hồng ngoại. Tuy nhiên ranh giới của các vùng quang phổ
là không cứng ngắc mà có thể chồng chéo lên nhau.

Hình 2.2 Các vùng trong bức xạ điện từ
Vùng ánh sáng bao gồm tia cực tím và ánh sáng khả kiến được gọi tắt là
vùng UV-VIS. Vùng UV-VIS được chia thành 3 vùng nhỏ :
Vùng tử ngoại chân không (UV xa) λ = 50-200 nm, tuy nhiên ít được sử
dụng vì :
• Có năng lượng khá lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết trong phân tử
• Bị hấp thu mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy của không khí
• Bị hấp thu bởi thạch anh (dùng làm cốc đo)
Vùng tử ngoại gần (UV gần): từ λ = 200-375 nm
Vùng khả kiến (Vis): từ λ = 375-800 nm
Có thể nói trong công tác kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm thuốc
nói riêng, phép đo UV-Vis đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích định tính,
thử tinh khiết và định lượng. Bên cạnh đó, phương pháp UV-Vis còn có thể dùng
để xác định hằng số phân ly acid-base Ka, xác định số tiểu phân hấp thu dung
Luận văn Đại Học

4

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
dịch (xác định đẳng quang). Phương pháp này phổ biến hằng ngày ở các phòng
thí nghiệm.
2.1.3 Định luật hấp thu
Có hai định luật thực nghiệm được công thức hóa cho cường độ hấp thụ.

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

Bảng 2.1 Tổ hợp màu phổ và màu bổ sung
Thứ
tự

λ (nm)

Màu phổ

Màu bổ sung

1

400-430

Tím

Vàng lục

2

430-480

Chàm

Vàng


Tím

7

580-595

Vàng

Chàm

8

595-650

Cam

Chàm lục

9

650-730

Đỏ

Lục vàng

10

730-760

liên hợp π-π trong phân tử dẫn đến tăng ε, thường kèm theo sự chuyển dịch đỏ.
Hiệu ứng giảm cường độ (hypochromic effect): có sự phân ly phân tử dẫn
đến giảm ε thường kèm chuyển dịch xanh.

Hình 2.3 Các hiệu ứng và sự dịch chuyển
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu
2.1.5.1 Cấu trúc phân tử
Cấu trúc phân tử ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thụ UV-Vis của phân tử.
Các yếu tố này có thể là hiệu ứng cảm ứng I, liên hợp và các hiệu ứng không gian
vị trí của các liên kết đôi ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thu của phân tử, đặc biệt là
các hệ liên hợp có thể làm thay đổi vị trí các cực đại hấp thu.
2.1.5.2 Môi trường
a. Dung môi
Độ phân cực của dung môi có thể làm biến đổi môi trường điện tử của nhóm
hấp thu mang màu. Một cách tổng quát, độ lớn của sự chuyển dịch có thể liên
quan đến độ phân cực của dung môi.
Khi chọn dung môi cho dung dịch đo phổ UV-Vis ngoài việc dựa vào độ
tan của chất cần nghiên cứu còn phải tính đến khả năng hấp thụ của chính dung
môi này.
b. Nồng độ
Thường thì nồng độ chỉ ảnh hưởng đến cường độ của dải. Ở nồng độ cao,
tương tác phân tử có thể gây nên sự thay đổi về dạng và vị trí của dải hấp thu.
Luận văn Đại Học

7

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS


8

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

Hình 2.4 Mô tả đường chuẩn của phương pháp đường chuẩn
2.1.6.3 Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là người ta dùng ngay mẫu phân tích làm
nền để chuẩn bị một dãy mẫu đầu bằng cách lấy một lượng mẫu phân tích nhất
định và thêm vào đó những lượng chất nhất định của hoạt chất cần xác định theo
từng bậc (theo cấp số cộng). Ví dụ thêm vào là C1, C2,… như thế chúng ta sẽ
được dãy mẫu chuẩn là:
C0 = Cx
C1’= (Cx+C1)
C2’= (Cx+C2)
C3’= (Cx+C3)
C4’= (Cx+C4)
Trong đó Cx là hàm lượng của hoạt chất cần xác định trong mẫu phân tích.
Tiếp đó cũng chọn các điều kiện thí nghiệm phù hợp và hoạt chất cần phân
tích, tiến hành ghi lại diện tích peak theo nồng độ.

Luận văn Đại Học

9

TÔN PHÚ TÙNG



TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
(5) Bộ khuếch đại tín hiệu
(6) Bộ phận ghi nhận tín hiệu.

Hình 2.6 Sơ đồ cấu tạo của một máy UV-VIS
Phân loại :
Các máy quang phổ UV-Vis được phân loại theo cấu tạo:
Loại một chùm tia (single beam): loại này để đo điểm, tức là ta đo độ
hấp thu của từng bước sóng một. Muốn thu được toàn bộ phổ tự ta phải xây
dựng lấy.

Hình 2.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ một chùm tia
Loại hai chùm tia (giống nhau về cường độ và λ): thông thường có bộ
phận tự ghi kèm và máy tự ghi toàn bộ phổ mà ta cần khảo sát.

Luận văn Đại Học

11

TÔN PHÚ TÙNG


ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS

Hình 2.8 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hai chùm tia
2.2 Tổng quan về HPLC