TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ SINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS. NGUYỄN PHÚC HƯNG

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
thầy TS. Nguyễn Phúc Hưng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã
hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận vừa qua.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy, cô giáo của Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình làm thực nghiệm tại trường.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo đã giảng dạy em trong
bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên ghế giảng đường đại học
sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................... 3
NỘI DUNG....................................................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ........................................................ 5
1.1.1. Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum ............................................................................ 5
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK ................................................................................................. 5
1.1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK .............................................................. 5
1.1.2. Giới thiệu về vật liệu CVK.................................................................................................... 6
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK .................................................................................................... 6
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của màng CVK..................................................................................... 7
1.1.2.3. Ứng dụng của màng CVK .................................................................................................. 8
1.1.3. Thuốc Omeprazole................................................................................................................. 8
1.1.3.1. Cấu trúc ............................................................................................................................... 8
1.1.3.2. Tính chất của Omeprazole ................................................................................................. 9
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................... 11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn ................................................................ 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc Omeprazole ...................................................................... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 14
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 14
2.1.1. Chủng vi sinh ....................................................................................................................... 14
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................................. 14
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................................. 14
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................................ 15
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo .................................. 15
2.3.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ................................................... 17
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK .............................................................................. 17


Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 2 (n = 3)............................... 26
Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 4,5 (n = 3)............................ 27
Bảng 3.3. Giá trị OD của dung dịch thuốc ở pH = 6,8 (n = 3)............................ 28
Bảng 3.4. Khối lượng Omeprazole nạp vào màng CVK tại thời điểm 2 giờ ...... 30
Bảng 3.5. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3) .................. 31
Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole từ màng CVK trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3) ................................................... 33
Bảng 3.7. Hệ số tương quan (R 2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau................................................ 34


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK ....................................................... 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Omeprazole ...................................................... 8
Hình 3.1. Màng CVK nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo .......................... 24
sau 6 ngày nuôi cấy ........................................................................................... 24
Hình 3.2. Thu màng CVK thô loại 6 x 3,5 ở các khoảng thời gian khác
nhau .................................................................................................................. 25
Hình 3.3. Thu màng CVK thô loại 5 x 2 các khoảng thời gian khác nhau.......... 26
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH = 4,5............. 28
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH = 6,8........... 29
Hình 3.7. Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng
CVK có độ dày 0,5cm và 1cm trong môi trường pH khác nhau (n=3) ............... 32
Hình 3.8. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc của màng CVK ..................................... 34


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (CVK) được tạo thành từ Acetobacter xylinum có cấu
trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý

Omeprazole. 80% các chất chuyển hóa (hydroxy-ome-prazole và acid
carboxylic tương ứng) bài thải trong nước tiểu. Phần còn lại 20% bài thải theo
phân. Tác dụng phụ của thuốc là: dung nạp tốt; buồn nôn, nhức đầu, đầy hơi
và táo bón rất hiếm; thỉnh thoảng có ban da, nhưng biểu hiện này thường nhẹ
và chóng hết; khó thở; sưng mặt, môi, lưỡi hoặc họng.
Tuy nhiên, Omeprazole làm chậm sự bài thải của diazepam, phenytoin
và warfarin (là những chất bị chuyển hóa do oxy hóa ở gan). Do đó, phải
giám sát bệnh nhân dùng các thuốc này cùng lúc với Omeprazole và giảm liều
lượng, nhất là với phenytoin.
Môi trường nước vo gạo có nguồn gốc từ thực vật, dễ kiếm, rẻ tiền và có
rất nhiều vi chất dinh dưỡng, vitamin thuộc nhóm B như vitamin B1,
B5,…vitamin E và một số thành phần có lợi khác thích hợp cho vi khuẩn
Acetobacter xylinum phát triển.
Với mục đích chế tạo màng sinh học CVK để khảo sát sự giải phóng
thuốc Omeprazole qua màng nhằm giúp thuốc được giải phóng một cách kéo
dài, chúng tôi đã chọn đề tài: “ Khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và tạo hệ thống CVK đã hấp thụ thuốc
được lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc Omeprezole từ hệ thống
trên nhằm tìm ra hệ thống có khả năng giải phóng thuốc kéo dài, có thể giúp
tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể để thuốc phát huy được hiệu quả tốt nhất
trong việc chữa trị bệnh, từ đó có thể làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc.

2


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc

độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho người
bệnh, giảm tác dụng phụ của thuốc không mong muốn.

4


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Giới thiệu về chủng Acetobacter xylinum
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
- Màng CVK được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,
Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…
- A. cetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Giống
vi khuẩn A. xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6-0,8µm, dài khoảng 2-3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già
hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
1.1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp Omeprazole nên có rất nhiều nghiên cứu và đề
nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ
đường, nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum.

Fe (7% - 8%), Zn (12% - 13%)

Axitamin

Leucine, Valine, Lysine

1.1.2. Giới thiệu về vật liệu CVK
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng CVK.
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
CVK là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng
Acetobacter xylinum. CVK cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4-

6


glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC),
tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [10]. Theo AJ. Brown (1886),
CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm,
kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành
dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm.
1.1.2.2. Tính chất độc đáo của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5nm. Sản phẩm này có các
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng

Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị
bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng CVK giúp vết
thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng [4]. Ngoài ra,
sản phẩm CVK còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu
thuật, ghép mô, cơ quan [2].
Ngoài ra, CVK còn được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như:
Trong công nghiệp giấy màu CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất
lượng cao, trong công nghiệp môi trường đã sử dụng CVK làm màng phân
tách để xử lí nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và
Fonah, 1998), làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học
sử dụng để cố định Protein [4].
1.1.3. Thuốc Omeprazole
1.1.3.1. Cấu trúc

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Omeprazole

8


Tên khoa học: 5 - methoxy-2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 pyridinyl) methyl] sulfinyl] 1H - benzimidazole.
1.1.3.2. Tính chất của Omeprazole
Lý tính: Omeprazole dưới dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà. Nóng
chảy ở khoảng 1550C kèm theo sự phân huỷ, khó tan trong nước, khó tan
trong aceton và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol
[8].
Hoá tính: Omeprazole vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ mạnh
bức xạ tử ngoại. Các tính chất này được ứng dụng trong định tính, định lượng
và trong bào chế Omeprazole. Độ ổn định của Omeprazole phụ thuộc vào pH.
Trong môi trường acid, Omeprazole nhanh chóng bị phân huỷ, trong môi
trường kiềm Omeprazole khá bền vững [8].

Thông số DĐH

Giá trị

AUC (µg.h/mL)

0,2 - 1,2

Cmax (µg/ml)

0,08 – 8

Tmax (h)

1–3

T1/2 (h)

0,6 – 1

Cl (L.h/kg)

0,45

Vd (L.kg)

0,31 – 0,34

Sinh khả dụng (%)
Đơn liều

dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm
ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm
[4]. Các tác giả Hamlyn và cộng sự (1997), Cienchanska (2004), Legeza và
cộng sự (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cộng sự (2006) sử dụng màng
đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt [4].
*Ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng được quan tâm. Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh và cộng sự
[4] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu
quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in
vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho
thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng
CVK có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị
bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.

11


Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng ”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có
sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển
vọng ứng dụng làm màng trị bỏng.
Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc
tính và cấu trúc màng. Về thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo
màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch
dừa. Hiện nay việc nghiên cứu CVK làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là

diclofenac, một số viên tác dụng kéo dài như theophylin, nifecdipin.
Gần đây, một số doanh nghiệp dược trong nước đã quan tâm, yêu cầu
đánh giá tương đương sinh học cho các sản phẩm sản xuất trong nước. Công
ty Dược VTVT Phú Yên, công ty TNHH dược phẩm Sài gòn (SPM), Công ty
Cổ phần Dược Hậu Giang, Imexpharn, Domesco, Công ty TNHH Hasan.
*Ở Việt Nam
Ở việt Nam, phần lớn Omeprazole được sử dụng là một loại thuốc chữa
trị bệnh trào ngược dạ dày thực quản và bệnh thực quản ăn mòn.
Tại một số đơn vị nghiên cứu như Viện kiểm nghiệm, trường đại học
Dược Hà Nội, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh... đã bắt đầu
triển khai nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm
Omeprazole [8].
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42
chế phẩm của Omeprazole lưu hành ở VN. Hiện nay, 37 sản phẩm có số đăng
kí còn hạn, trong đó có 25 sản phẩm nước ngoài và 12 sản phẩm trong nước.
Các sản phẩm này có giá trị chênh lệch nhau khá nhiều.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi sinh
Vi khuẩn tạo cellulose từ dịch trà xanh lên men [1, 2] được nuôi cấy tại
Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

5

Disodium phosphate

Trung Quốc

6

Axit citric

Trung Quốc

7

Peptone

European Union

8

Natri hidroxit

Việt Nam

9

Nước cất 2 lần

Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP
Hà Nội 2

Máy đo quang phổ UV-

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Shimadru - Nhật Bản Viện NCKH&ƯD Trường

Vis 2450
Cân phân tích

Địa điểm nghiên cứu

ĐHSP Hà Nội 2
Sartorius - Thụy Sỹ

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Buồng cấy vô trùng

Haraeus

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Tủ sấy, tủ ấm

Binder - Đức

Viện NCKH&ƯD Trường


Khối lượng

Nước vo gạo

1000 ml

Glucose

20 g

KH2PO4

2g

(NH 4)2SO4

3g

Pepton

4g

Acid acetic

5 ml

10% dịch giống A.xylium
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi
trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có

tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là đường glucose và protein
của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng.

17


+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo
kết tủa của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Màng CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất,
lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid triclor acetic
1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng. Mẫu chứng
âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử
dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục. So sánh
với mẫu chứng âm không chứa protein.
Màng CVK tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những
tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có
tính che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô.
2.3.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn