ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ
ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum
carmichaelii Debx.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ
ĐOẠN GEN MATK/ITS Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum
carmichaelii Debx.)
Ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

THÁI NGUYÊN - 2018


bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi.
Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong
luận văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để
luận văn
thêm hoàn thiện.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả

ii


Nguyễn Thị Loan

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................iv DANH
MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ v DANH
MỤC CÁC HÌNH.............................................................................................vi MỞ ĐẦU
....................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................................
2
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................................. 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu ............................................................................... 3


iv
ivi


2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái ....................................................
13
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá .....................................
14
2.2.3. Phương pháp phân tử .........................................................................................
15
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................... 18
3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu ....................................... 18
3.1.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 18
3.1.2. Cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu ....................................................................... 20
3.2. Kết quả phân lập đoạn gen matK và trình tự ITS.................................................. 27
3.2.1. Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch matK ....................................................... 27
3.2.2. Nhận diện mẫu Ô đầu bằng mã vạch ITS .......................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................................ 34
1. Kết luận .................................................................................................................... 34
2. Đề nghị..................................................................................................................... 34

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN .................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36
PHỤ LỤC

iv



Genbank

:

Ngân hàng gen

ITS

:

Internal Transcribed Spacer

Kb

:

Kilobase

matK

:

MaturaseK

NCBI

:

The


Hình 1.1. Cấu trúc gen matK ............................................................................. 10
Hình 1.2. Cấu trúc vùng gen ITS ....................................................................... 11
Hình 3.1. Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx) ........................................ 18
Hình 3.2. Cơ quan sinh sản của cây Ô đầu ........................................................ 19
Hình 3.3. Lớp biểu bì dưới của lá cây Ô đầu .................................................... 21
Hình 3.4. Lớp biểu bì trên của lá cây Ô đầu...................................................... 22
Hình 3.5. Cấu tạo sơ cấp cuống lá ..................................................................... 22
Hình 3.6. Cấu tạo rễ cây Ô đầu.......................................................................... 23
Hình 3.7. Cấu tạo sơ cấp thân cây Ô đầu .......................................................... 25
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen matK của mẫu
cây Ô đầu ............................................................................................. 27
Hình 3.9. Kết quả phân tch bằng BLAST đoạn gen matK phân lập từ mẫu
Ô đầu ................................................................................................... 28
Hình 3.10. Trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Ô đầu Hà Giang và
của cây Ô đầu mang mã số KY407560 trên GenBanK....................... 29
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu
thuộc chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK.....
30
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản vùng ITS từ
hệ gen cây Ô đầu ................................................................................. 31
Hình 3.13. Kết quả phân tch bằng BLAST đoạn DNA phân lập từ mẫu Ô
đầu Quản Bạ, Hà Giang....................................................................... 32
Hình 3.14. Trình tự nucleotide vùng ITS của mẫu Ô đầu Quản Bạ, Hà
Giang và của cây Ô đầu mang mã số KU041716 trên GenBanK ....... 32
Hình 3.15. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Ô đầu
trong chi Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS ...........
33
vi




chóng

2


được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các
cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có thể định danh được loài và xác định
được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Vì vậy, các
kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho
việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã vạch DNA được xem
như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền
giữa các loài.
Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là rất cần thiết và có ý nghĩa
trong việc giám định, bảo tồn và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật. Hiện nay, ở
Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã bắt đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng
nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã
vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật, góp phần phân loại, bảo tồn và phát
triển nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS ở cây Ô đầu
(Aconitum carmichaelii Debx.)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm thực vật học và đoạn gen matK/ITS từ cây Ô
đầu làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Ô đầu (Aconitum
carmichaelii Debx.) tại Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tch đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu rễ, thân, lá của cây Ô đầu
- Nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen matK/ITS từ cây Ô đầu ở
Việt Nam.

lan

(Magnoliophyta) [12].
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng hiện nay có nguồn gốc từ Trung Quốc
di thực vào Việt Nam vào những năm 70 của thế kỷ trước. Gần đây diện tch
cây Ô đầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại cây trồng rừng và cây đặc sản
ở vùng núi phía Bắc, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho ngành y học nói riêng và
nền kinh tế nói chung. Cây Ô đầu mọc trên cạn và là cây thích nghi tốt với điều
kiện khí hậu lạnh, mát. Vì vậy, hiện nay cây Ô đầu được trồng nhiều ở những
vùng núi cao thuộc các tỉnh như: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [17].
Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã được xác định bởi 2 tên là: A. fortunei
Hemsl và A. carmichaelii Debx. Theo một số nghiên cứu, tên khoa học của cây
Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là Aconitum carmichaelii Debx. Việc xác định


tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở các địa phương khác cũng chưa được
thực


hiện. Do đó, cần có nghiên cứu định danh tên khoa học chính xác của cây Ô
đầu [3], [5].
1.1.3. Vai trò của cây Ô đầu
Trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alcaloid,
polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính. Trong các bộ
phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid
chính có trong củ Ô đầu. Ngoài ra, trong củ Ô đầu còn có tinh bột,
đường, manit, chất nhựa, các acid hữu cơ chất béo và sterol. Ở thân, lá và
hoa cây Ô đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo

1.2. Phương pháp phân loại học phân tử
1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA
Hiện nay, để phân loại và xác định loài thực vật người ta có thể sử
dụng nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau. Nhưng các phương
pháp đều có chung nguyên tắc là dựa vào các thông tin như: có chung một
nguồn gốc, có nhiều tnh chất giống nhau về các đặc điểm hình thái, giải
phẫu, sinh lý, sinh hoá….
Việc phân loại và xác định loài đối với thực vật dựa trên các đặc điểm về
hình thái thông qua nhận biết cơ quan, bộ phận của cây như lá, hoa, quả hoặc
chu kỳ sống, cách thức phân cành, … Với phương pháp truyền thống này có ưu
điểm là dễ quan sát trực tiếp bằng mắt thường nhưng chỉ dựa vào sựu thống
kê phân tích một hoặc một số tnh trạng được thể hiện ra bên ngoài thì hiệu
quả không cao. Hơn nữa, khi sử dụng phương pháp này sẽ gặp nhiều khó khăn
khi các mẫu cần giám định không còn nguyên vẹn đặc điểm hình thái bên
ngoài. Bởi vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại sẽ hỗ trợ
việc định danh loài chính xác hơn, đặc biệt trong trường hợp mẫu thực vật đã
bị tác động thay đổi hình thái (các bộ phận của cây đã bị cắt thái, sấy khô…).
Hiện nay, trên thế giới phương pháp phân loại học phân tử để xác định
loài là hướng nghiên cứu đang phát triển mạnh, được xây dựng dựa trên việc
nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu ở sinh vật. Trong đó, kỹ
thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp đạt hiệu quả cao trong việc định
loại và giám định loài [32].


Năm 2003, Hebert P.D., nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đã đề xuất mã vạch DNA (DNA Barcode, chỉ thị DNA) giống như một
cách để xác định loài. Mã vạch DNA được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ
một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận
diện được các loài [20].
Một mã vạch DNA điển hình đảm bảo được các yêu cầu:

Hiện nay, có rất nhiều vùng gen được đề xuất làm chỉ thị cho mã vạch
DNA ở thực vật. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà
phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [28]. Vì vậy, các nhà nghiên cứu
cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ sử dụng không chỉ một mà kết
hợp nhiều vùng mã vạch DNA cho việc định danh loài đối với thực vật [22].
Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là phải phổ biến và đặc
hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Có nghĩa là các đoạn gen được sử
dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến
đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi
không đáng kể. Do đó, mã vạch DNA lý tưởng là một đoạn DNA có
trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để
dễ dàng khuếch đại bằng PCR [20].
1.3. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử
1.3.1. Nghiên cứu sử dụng phân loại học phân tử trên thế giới
Hiện nay trên thế giới đã ứng dụng nhiều phương pháp hiện đại như
phương pháp phân tích DNA trong việc phân loại và giám định mẫu vật. Phân
tch DNA cụ thể là kỹ thuật mã vạch DNA đã xác định chính xác tên loài và
đánh giá có hiệu quả trong việc giám định loài [28], [32].
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA ở thực vật để xác
định một mã vạch DNA tiêu chuẩn đối với thực vật. Dựa trên các kết quả
nghiên cứu giám định loài thực vật mà đã thực hiện trên nhiều mẫu thực
vật khác nhau, có các đại diện cho thực vật hạt kín, thực vật hạt trần, các vùng
gen được lựa chọn như: gen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoB, gen
rpoC1, psbK-psbI và gen trnH-psbA. Dựa trên những đánh giá có khả năng


thu được,


chất lượng và mức độ phân biệt giữa các loài, nhiều nghiên cứu đã đưa ra