ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC NAM

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA
(DEDROBIUM NOBILE LINDL)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC NAM

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA
(DEDROBIUM NOBILE LINDL)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN


TỪ

VIẾT

TẮT

.................................................................vi

VÀ

KÝ

MỞ

HIỆU
ĐẦU

......................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN ...............................................................
3
1.1.1. Phân loại và nguồn gốc ..................................................................................... 3
1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium).................................................................... 4
1.2. MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC ..............................
7
1.2.1. Lan Thạch hộc ................................................................................................... 7
1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme............................................ 9
1.2.3. Dendrobium officinale ...................................................................................... 9
1.2.4. Các Dendrobium khác ..................................................................................... 10
1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC ................................................

3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU............................................................................ 23
3.2. KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM ......................................................... 25
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tăng sinh protocorm ................. 25
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm 26
3.2.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát sinh chồi protocorm................. 28
3.2.4. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ protocorm ..... 29
3.3. KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO ............. 31
3.3.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc ........................ 31
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh nghiền đến sự phát triển
chồi lan Thạch hộc .................................................................................................... 33
3.3.3. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc .......................... 35
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY ............................................ 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 42

iii
iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc....................................... 23
Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt lan Thạch hộc ................................................. 24
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng phát sinh Protocorm..... 26
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanh
protocorm ............................................................................................................ 27
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng phát sinh chồi từ
cụm protocorm .................................................................................................... 28
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm

nhau sau khi ra chai và huấn luyện tại vườn ươm .............................................. 37

vv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Chữ viết tắt (ký hiệu)

Tên đầy đủ

ABA

Abscisic acid

ADN

Acid deoxyribonucleic

APG III

Angiosperm Phylogeny Group
III

B1

Thiamine

B2

Riboflavin


VW

Vacin Went

USA

United States of America

2,4 - D

2,4 - Dichlorophenoxy acetic
acid

α - NAA

α - Naphthalene acetic acid

vi
vi


MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

1


Bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu dân gian đang trở thành vấn
đề cấp thiết, do tình trạng khai thác bừa bãi, thiếu khoa học cũng như sự giảm

giống cao có thể tạo ra rất nhiều cây con in vitro đồng đều mang các đặc điểm
ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp phần thực
hiện công tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt hơn. Thêm vào đó, phương pháp
nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thực vật có thể tạo ra các cây con sạch virus từ cây
mẹ đã bị nhiễm bệnh (phục tráng giống cây trồng). Hơn nữa, nuôi cấy mô, tế
bào còn cung cấp nguyên liệu cho việc tạo ra giống mới bằng công nghệ gen, lai
soma, chọn dòng tế bào… mang các đặc điểm tốt như có hoạt tính sinh học cao,
có khả năng kháng bệnh virus, chịu hạn, chịu các yếu tố bất lợi từ môi trường.
Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu nhân giống
in vitro lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)"
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng
Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho công tác bảo tồn và cung cấp giống lan
Thạch hộc.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu đối với lan Thạch hộc.
2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình
tái sinh chồi, sự phát triển chồi và ra rễ của lan Thạch hộc in vitro.
3. Nghiên cứu giá thể phù hợp để ra cây đối với lan Thạch hộc.

3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN
1.1.1. Phân loại và nguồn gốc
Họ lan hay họ Phong lan (Orcchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc
bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (monocotylendons). Họ
Phong lan là một trong những họ thực vật lớn nhất và phân bố khắp nơi trên thế

Ở Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng, bao gồm địa
lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước .
Theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia làm hai nhóm là nhóm
cây đơn thân (monopodia) và nhóm cây đa thân (sympodia). (1) Thuộc nhóm
cây đơn thân thì cây chỉ có một trụ phát triển duy nhất, lá mầm từ đỉnh mọc
thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa
tới vài mét. (2) Thuộc nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến
một kích thước nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát
triển thay thế. Thân mầm phát triển từ mắt cây. Các mắt cây phát triển đến một
kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ
4


phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ
gốc ban đầu [6].
1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)
a. Phân loại chi lan Hoàng thảo
Chi lan Hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium thuộc họ thực vật
Orchidacea, là một chi hoa rất lớn bao gồm trên 1500 loài, sinh sống tự nhiên
trong một khu vực trải rộng từ Triều Tiên, Nhật xuống Mã Lai, Indonesia, đến
Úc và New Zealand. Dendrobium là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau
lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở
các vùng châu Úc, châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan
Dendrobium là một họ lan nhiều sắc thái bao gồm cả những loài rụng lá và loài
có lá xanh quanh năm. Đa số lan tự nhiên thuộc loài cộng sinh, sống bám trên
cây hoặc trên đá, có những giả hành dài từ vài cm (D. leucocyanum) đến vài
thước (D. discolor), thân gầy, uốn cong khi phát triển hoặc mập mạp và đứng
thẳng. Lan Dendrobium có thể có lá thon nhỏ, mọc chéo theo suốt chiều dài của
thân. Lá nơi gốc có thể mọc bao kín chồi.Cần hoa cũng dài hay ngắn khác nhau,
từ vài cm đến 1m. Cây mang từ 1-4 hoa (D. nobile) nhưng cũng có thể đến cả

đầu các cành già không còn lá. Cây cần có mùa đông lạnh để trổ hoa. Nhóm này
có Den. Anosmum (Phi điệp), Den. chrysanthum, Den.falconeri, Den.
fimbriatum, Den. findlayanum, Den.friedricksianum, Den. heterocarpum,
Den.loddigesti, Den. moniliforme, Dem. Nobile (Thạch hộc), Den. Parishii
(Trầm), Den. primulinum, Den. transparent và Den. wardianum
(4)

Formosae: Lá không rụng, hẹp; giả hành mọc thẳng đứng có những

đám lông đen nơi nối kết của lá. Hoa trắng, lớn đến 10 cm, có những điểm vàng,
cam, lục hoặc tím. Trong nhóm có Den. bellatulum (Bạch hỏa hoàng), Den.
draconis (Nhất điểm hồng), Den. formosum (Bạch nhạn), Den. infundibulum,
Den. lowii, Den.lyonii, Den. margaritaceum, Den. sanderae
(5)

Latura : Không rụng lá, có giả hành dày, to cỡ trung bình. Hoa

thường màu vàng-xanh đến xanh lục gồm Den. atroviolaceum, Den. johnsoniae,
Den macrophylum, Den. spectabile.
(6)

Oxyglossum : Nhóm lan rừng, nhỏ, không rụng lá, gặp tại vùng núi

cao. Hoa lâu tàn , nhiều màu sắc. Gồm Den. bellwigianum, Den. cuthbersonii,
Den. laviefolium, Den. vexillarius
Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan
Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính là (1) Nhóm thân mềm: Có đặc
điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu
lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên
độ cao 1000 m; (2) Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn

cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:
+ Bệnh hại trên lan
- Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp. gây nên, cách phòng trị là
tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào
thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như
Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000.

6


- Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp. gây nên, bệnh thường phát sinh
mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có
độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb
3/2000; Benlat 1/2000.
- Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum sp. gây ra. Bệnh phát triển
mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun
thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/1 lần.
- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết
bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo
chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh
mô bệnh khô tóp có màu trắng xám.
Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng
và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm bệnh.
Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do
thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối. Phun thuốc
phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun
nhiều hơn (1 tuần 2 - 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun
theo cách phòng ngừa.
+ Sâu hại lan:
- Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị

- Thạch hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam,
Quảng Châu ở độ cao 600 - 1700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá
ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma,
Thái Lan, Việt Nam. Loài này rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao,
cũng có tác dụng nhất định về công năng dược liệu.
- Thạch hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân
bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công
dụng làm thuốc chữa một số bệnh.
- Thạch hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ
cao 750 - 1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh.
- Thạch hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây
gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1600 m, phân bố ở
Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam.
8


- Thạch hộc Hooc sơn phân bố ở huyện Hooc Sơn, An Huy - Trung Quốc,
có công dụng làm dược liệu để chữa một số bệnh.
- Thạch hộc Thủy thảo rất dễ trồng, sinh trưởng nhanh, năng suất cao,
cũng có công năng làm dược liệu.
Trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệt phẩm của
Thạch hộc. Thạch hộc rỉ sắt là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách
đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt. Quý tộc thời Trung
Hoa cổ đại coi Thạch hộc rỉ sắt là “nàng tiên” hay “cỏ cứu mệnh”, được dùng
trong nhiều vị thuốc và chữa được nhiều bệnh theo kinh nghiệm của dân gian
[22].
1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium
moniliforme
Phong lan với thân cao khoảng 30 - 40 cm gồm nhiều đốt, mỗi đốt dài
chừng


chứng minh qua các thử nghiệm 'in vitro'. Dịch chiết từ D. officinale có hoạt tính
làm hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline và
bằng streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta,
đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự
phân hủy của glycogen trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan. D.
officinale là một trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là
những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế
bào ung thư khác nhau [8].
1.2.4. Các Dendrobium khác
Một số Dendrobium khác đã được nghiên cứu về hoạt chất cùng khả
năng trị bệnh như:
- Dendrobium densiflorum: Trong cây có Scopoletin và Scoparone có
hoạt tính ngăn chặn sự kết tụ tiểu cầu.
- Dendrobium chrysanthum: Trong đọt có erianin có hoạt tính diệt bào
chống sự bội sinh của tế bào ung thư máu HL-60 do khả năng tạo tiến trình tự
hủy (apoptosis) và gây trở ngại cho sư phân lập bcl-2 và gen bax trong HL-60.
Erianin còn có tác động làm teo bướu ung thư , gây hoại tử tế bào ung thư và
chặn sự chuyển vận dưỡng chất qua vi mạch tế bào ung thư khi thử trên tế bào
ung thư gan hepatoma Bel7402 và melanoma A375 [8].
- Dendrobium amoenum var. denneanum: Hợp chất loại dihydrostibene,
isoamoenylin có hoạt tính chống oxy-hóa khá mạnh.
1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC
1.3.1. Đặc điểm thực vật học
Thạch hộc rỉ sắt (Dendrobium nobile Lindl.) thuộc nhóm cây đa thân,
thân mọc khỏe chia nhiều đốt ngắn, có nhiều rễ khí sinh. Cây biểu sinh trên cây
gỗ hay vách đá, cao 30-60 cm, đường kính 1,3 cm, thường mọc thành khóm.
Thân hơi dẹt có rãnh dọc, khi khô có màu vàng rơm. Lá mọc so le hai bên thân
dài 6-12 cm, rộng 1-3 cm, không lông, dễ rụng. Hoa to xếp thành bó 1-4 cái ở
sát nách lá, hoa dài 4-4,5 cm, rộng 3-3,5 cm, màu hồng tía ờ chót đầu của cánh

nắng cho chóng khô, sau sấy thêm và xông diêm sinh cho vàng và khô đều. Ở
11


những nơi có nhiều dược liệu và có điều kiện tập trung thì nên xây lò sấy như
một gian chuông kín, làm giàn nhiều tầng để rải mỏng dược liệu từng lớp, đốt
than củi mà sấy, và trở luôn cho đều, thì không cần phải luộc trước. Tiện nhất là
làm lò sấy bằng tôn, để lưu động. Và nếu khai thác với quy mô lớn thì tốt nhất
xây lò gạch chịu lửa kiểu như lò bánh mỳ, đốt lò để sấy với hơi nóng hẩm đều
thì phẩm chất đảm bảo và sau không cần xông diêm sinh nữa.
Cao Thạch hộc: Để khỏi phải phơi sấy phức tạp và chuyên chở công kềnh
tốn công, ta nên nấu cao thạch hộc tại chỗ: đập dập thân cây, cắt khúc nấu, lọc,
cô thành cao, 100kg dược liệu tươi cho 8 lít cao lỏng như mật ong, dùng rất tốt
và rất tiện trong việc trị bệnh cũng như tẩm bổ [1].
1.3.3. Công dụng và thành phần hóa học
Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch
hộc tía giàu polysacharide Thạch hộc, alkaloid Thạch hộc, các acid amine và
nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi
lượng, trong đó polysacharide Thạch hộc tới 22%, hàm lượng các acid amine
như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine.
Ngoài ra, Thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như este và các
chất phenanthryn, bibenzyl, keton, nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch
hộc tía có hàm lượng alkaloid sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất
amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine,
dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac Nmethyl-dendrobium, các chất này có vị hơi đắng. Thân Thạch hộc có dầu bay
hơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%.
Giá trị: Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác
định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc,
Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông
trùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng. Giá trị của thạch hộc có 2 loại

lâu làm việc trí óc sinh đau lưng mệt mỏi, hỏa bốc nhức đầu ù tai, đỏ mồ hôi trộn,
khó ngủ, chán cơm dùng cao Thạch hộc uống mỗi lần 4ml, ngày uống 3-4 lần.
Chữa di tinh, đái đường: Thạch hộc, Kim anh tử mỗi vị 16g sắc uống với
bột Hoài sơn, củ Súng mỗi vị 12g, chia làm 3 lần [1].
13