TRƯỜNG ĐAI HOC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LÊ HỮU BẢO TRÂN
MSSV: 12D720401175
Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017


TRƯỜNG ĐAI HOC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại
phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy
cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp
thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận.
Cần Thơ, tháng 6 năm 2017
Sinh viên

Lê Hữu Bảo Trân


TÓM TẮT
Hai hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến nhất là imidacloprid và azoxystrobin được
nhiều nông dân tin dùng vì hai loại này có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa sâu bệnh
và nấm mốc gây hại, nên imidacloprid và azoxystrobin được chọn trong nghiên cứu
này. Điều này đặt ra yêu cầu cần có phuơng pháp phân tích chính xác và đơn giản xác
định hai hoạt chất trên. Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định
lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC). Kết quả nghiên đã lựa chọn được với điều kiện sắc ký trong đó cột
sắc ký RP- C18 (250 x 4,6mm, 5µm), pha động gồm acetonitril –nước với tỷ lệ (55%:
45%), tốc độ dòng 1ml/phút và phát hiện ở bước sóng 250 nm. Cả hai chất đã
tách được hoàn toàn trong thời gian 15 phút. Giới hạn định lượng của imidacloprid
và azoxystrobin lần lượt là 0,0048 ppm và 0,048 ppm. Diện tích pic và nồng độ có
mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan của imidacloprid là 0,9978 và
của azoxystrobin là 0,997. Phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng 98-102% và độ
lặp lại tốt với RSD < 2%. Vì vậy quy trình có thể sử dụng để định lượng
nhanh imidacloprid và azoxystrobin từ đó xác định dư lượng của hai chất này
trong dược
liệu.
Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC.


.... 6
2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC ...8


2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và
azoxystrobin. ........................................................................................................
8i


2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .......9
2.2.1. Khái niệm .......................................................................................................9
2.2.2. Phân loại
.........................................................................................................9
2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................................9
2.2.3.1. Bình đựng dung môi ..............................................................................10
2.2.3.2. Bộ phận khử khí ....................................................................................10
2.2.3.3. Bơm cao áp
............................................................................................11
2.2.3.4. Bộ phận tiêm
mẫu..................................................................................11
2.2.3.5. Cột sắc ký ..............................................................................................11
2.2.3.6. Đầu dò ...................................................................................................11
2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu ..............................................................................11
2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu ..................................................................................12
2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột
....................................................12
2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ......................................................................12
2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC ............................................................13
2.2.6.1. Thời gian lưu tR ....................................................................................13
2.2.6.2. Hệ số phân bố K ....................................................................................14

3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................21
3.1.2.1 Thiết bị....................................................................................................21
3.1.2.2. Dụng cụ .................................................................................................22
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...............................................................................22
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................23
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch ......................................................................................23
3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký.............................................23
3.3.2.1. Chọn cột.................................................................................................23
3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector
................................................................23
3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC.................................................23
3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động
..............................................................24
3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng
.............................................................................25
3.3.3. Thẩm định phương pháp
..............................................................................25
3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống
...........................................................................25
3.3.3.2. Tính đặc hiệu .........................................................................................26
3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ...........27
3.3.3.4. Tính tuyến tính ......................................................................................27
iii


3.3.3.5. Độ chính xác..........................................................................................28
3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) ...................................................................28
3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả .......................................................29
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................30


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ viết tắt

Từ nguyên (nghĩa tếng Việt)

ACN

:

Acetonitrile

As

:

Hệ số đối xứng

DĐVN

:

Dược điển Việt Nam

HPLC

:

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)


:

Part per million (phần triệu)

Rs

:

Resolution (Độ phân giải) RSD

:

Relative Standard Deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)

SD

:

Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

Speak

:

Diện tích pic sắc kí

UV

:

Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin
..42

vi
i


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid....................................................4
Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin ...................................................6
Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi ................................................................18
Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC ..............................21
Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu ......................21
Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước ......................................24
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid............................36
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin ..................................37
Bảng 4.3. Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin
trước khi tiêm vào hệ thống HPLC ...............................................................................40
Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn ...........41
Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn ...........41
Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid ..............................43
Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin ..................................43
Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid..............................44
Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid ......................................44
Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin ....................................45
Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid ...........45
Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin ...................46
Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và
azoxystrobin...................................................................................................................48


1.2. MỤC TIÊU
Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:
 Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng
phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.
 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin.
1


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU
2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với
mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ
trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong
muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất,
chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ
gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn
trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Hóa chất bảo vệ
thực vật còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng
lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có
thể dùng hóa chất bảo vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để
bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao
Sơn, 2015).
2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau:

- Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng. Chúng bao
gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn
trùng như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl
bromide…. Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ

Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi
nhất. Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp,
trừ mối,….Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5
cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp…(Sacramento, 2002).
2.1.3.2. Cấu tạo[31]

Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid
- Tên chung quốc tế: imidacloprid
- Công thức phân tử: C9H10ClN5O2
- Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol
- Danh pháp IUPAC: N-[1-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl]-4,5dihydroimidazol-2-yl]nitramide
- Loại HCBVTV: thuốc trừ sâu
- Nhóm: Neonicotinoid
2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học (Sprivastava, 2004)
- Dạng bột tinh thể màu hoặc bột màu be, có mùi đặc trưng nhẹ
-

Tỷ trọng: 1.54 g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy ở 144oC
- Áp suất hơi: 1.00 x 10-7 mm Hg (20oC)
- Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo
- Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20oC)
- Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25oC ở pH 7)
4


-

Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane,

nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng,
lơ
mơ, trầm cảm, chuột rút, run
rẩy và rối loạn hô hấp.
Gây kích ứng mắt

Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người
ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không
tỉnh táo và sốt. Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid
có trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004).
 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người
có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004).
2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004)
Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây
kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm
này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương.
Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế
bào thần kinh của côn trùng. Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ
và ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người.
Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa
6


và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ.

7


2.1.4. Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012)
2.1.4.1. Khái niệm


Kết quả

Chuột đực

uống

Chuột đực và cái

da

Chuột đực và cái

hít

Thỏ đực

da

Không gây kích ứng trên da

Thỏ đực và cái

mắt

Không gây kích ứng trên da

LD50 > 2000 mg / kg.
Không có tác dụng phụ
LD50 > 2000 mg / kg

2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin
- Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP,
Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP, Abaplus 100EC…[32]
- Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top
325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC,
500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 400SC , Paramax 400SC[34].
Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc
trừ sâu, hóa chất bảo vệ thực vật.
2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp
HPLC


Phương pháp 1(J.Serb, 2009)


- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril / 0,01 M dung dịch đệm phosphate (pH 3.0) với tỉ lệ
25%: 75%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Nhiệt độ 25oC
- Bước sóng: 270 nm
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
Phương pháp 2 (Sacramento, 2002):
- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Đầu dò UV-Vis
- Pha động: acetonitril 30% : Nước 70%
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng 270 nm