TÊN ĐỀ TÀI.txt
Khảo sát sơ bộ thành phần có bào tử nấm linh chi phá vỡ vách bằng Enzyne và siêu
âm
Giảng viên hướng dẫn: TS: Nguyễn Hoài Hương
SV: Lê Nguyễn Phương Uyên
lớp: 13DSH06
MSSV: 1311100859

Page 1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn
trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin,
tài liệu trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Lê Nguyễn Phương Uyên


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí
Minh - HUTECH đã tạo cơ hội cho tôi được học tập tại trường. Cảm ơn quý thầy cô
trong khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã truyền đạt lại những
tri thức quý báu cho chúng tôi trong thời gian học tập tại trường. Tôi cũng xin cảm
ơn khoa Dược đã giúp đỡ tôi về thiết bị siêu âm để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp
này. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương, người
đã tận tình trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp
này
Cùng với đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và các bạn học đã có những động


6.

Hạn chế của đề tài ..............................................................................................3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................4
1.1.

Tổng quan về nấm linh chi ............................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố .......................................................................4
1.1.2

1.2

1.3

1.4.

Bào tử nấm Linh chi .............................................................................10

Thành phần hóa học chủ yếu ......................................................................13
1.2.1 Các polysaccharide và các peptidoglycan ............................................15
1.2.2

Triterpenes ............................................................................................17

1.2.3

Saponin .................................................................................................23


1.4.2. Phương pháp trích ly hoạt chất...........................................................28
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................29
2.1

2.2

Phương tiện nghiên cứu ...............................................................................29
2.1.1 Vật liệu ..................................................................................................29
2.1.2

Nơi thực hiện ........................................................................................29

2.1.3

Thời gian thực hiện ...............................................................................29

Vật liệu thí nghiệm .......................................................................................29
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................29
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................30

2.3.

Phương pháp nghiên cứu.............................................................................32
2.3.1 Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp
sử dụng enzyme Cellulase C20032 10% và dịch tăng sinh nấm Trichoderma
harzianum T2 ....................................................................................................33
2.3.1. Quy trình trích ly các hợp chất có trong bào tử nấm Linh Chi .........33
2.3.2. Định tính một số hoạt chất có trong mẫu bào tử nấm Linh Chi .......36
2.3.2.1.


3.1.1.1.

Định tính protein ............................................................................44

3.1.1.2.

Định tính saponin ...........................................................................45

3.1.1.3.

Định tính carbohydrate ..................................................................49

3.1.1.4.

Định tính triterpenoid ....................................................................50

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.1.2. Định lượng thành phần trong mẫu dịch ......................................................53
3.1.2.1. Định lượng Carbohydrate trong dịch trích ly của mẫu không siêu âm
và mẫu kết hợp siêu âm ở các mốc thời gian 1,5 phút, 2,5 phút, 5 phút bằng
phương pháp Phenol – Sulfuric .........................................................................53
3.1.2.2. Định lượng lipid trong các mẫu không siêu âm và các mẫu kết hợp
siêu âm ở các mốc thời gian khác nhau trước khi trích ly bằng phương pháp
Adam – Rose – Gottlieb .........................................................................................
55
3.2. Bào tử ......................................................................................................58

(định tính carbohydrate) ...........................................................................................49
Bảng 3.7 Bảng kết luận thử nghiệm Liebermann – Burchard của mẫu không siêu âm
và siêu âm (định tính Triterpenoid) ..........................................................................51
Bảng 3.8 Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính với mẫu không siêu âm, siêu âm
và bào tử ....................................................................................................................51
Bảng 3.9 Mật độ quang của dung dịch D-Glucose chuẩn ........................................53
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên hàm lượng carbohydrate .............54
Bảng 3.11 Hàm lượng lipid tổng trong các mẫu (g) .................................................56
Bảng 3.12 bảng kết luận thử nghiệm tạo bọt và Fontan – Kaudel với bào tử ..........59
Bảng 3.13 bảng kết luận thử nghiệm Biuret với bào tử (định tính Protein) .............60
Bảng 3.14 bảng kết luận thử nghiệm Molisch với bào tử (định tính Carbohydrate) 61

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.2: a) Bào tử nấm linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần ...........11
b) Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ vách. .....................................................................11
Hình 1.3 Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh Chi ..................................12
Hình 1.4 Cấu trúc không gian của Polysaccharide trong nấm Linh chi ..................16
Hình 1.5: Công thức của một số triterpene trong nấm linh chi ................................18
Hình 1.6: Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi
...................................................................................................................................20
(Bingji Ma et al. (2011)) ...........................................................................................20
Hinh 1.7: Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et
al.(2011). Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi ............................21
Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm tổng quát ..................................................................32
Hình 2.2 Hình minh họa các pha trong phễu chiết ...................................................34

vi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, dược liệu thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan

trọng trong việc phòng bệnh, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe. Từ lâu nấm Linh chi
đã là thảo dược quý hiếm, được xem như một loại “Thần dược”. Theo Đông y, Linh
chi có tác dụng kiện não, bảo an, cường tâm, giải độc... Theo Tây y, từ Linh chi
người ta cũng đã bào chế được thuốc chữa nhiều bệnh, đáng quan tâm như bệnh tiểu
đường, viêm gan, ung thư.
Trong những năm vừa qua, các phương pháp phân tích hiện đại đã cho phép
xác định lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm Linh chi
như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, amino acid... trong
đó polysaccharide, triterpenoid được xem là thành phần chính mang nhiều hoạt tính
sinh học của nấm. Tuy các hoạt chất sinh học đã được tìm ra nhưng việc phân tích,
chiết xuất các hoạt chất sinh học này chủ yếu được thực hiện trên quả thể và tơ nấm
Linh chi, có rất ít nghiên cứu về việc thực hiện trên bào tử nấm Linh chi bởi bào tử
nấm Linh chi được cấu tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững, làm giảm khả năng chiết
xuất các chất. Vì vậy việc phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi và xác định sự hiện diện
của các hợp chất hóa học có trong bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng.
Để đóng góp một phần nhỏ của mình vào việc nghiên cứu xác định các hoạt
chất có trong bào tử nấm linh chi, tôi đã có những nghiên cứu sơ bộ được thực hiện
trong đồ án tốt nghiệp: “Khảo sát sơ bộ thành phần có trong bào tử nấm Linh Chi
phá vỡ vách bằng enzyme và siêu âm”.

enzyme và siêu âm. từ đó đề nghị quy trình sản xuất viên nang chứa dầu bào tử.
4.

Nội dung
Định tính và định lượng thành phần hóa học chính trong dịch trích ly bào tử

nấm Linh Chi phá vỡ bằng enzyme và siêu âm.
Định tính và định lượng thành phần còn lại trong bào tử nấm Linh Chi phá vỡ
sau trích ly.
Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh Chi bằng enzyme và siêu âm và sản
xuất viên nang chứa dầu bào tử
Phương pháp nghiên cứu
Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm
5.

Kết quả thu được của đề tài
Định tính được protein, saponin, carbohydrate ,triterpenoid có trong bào tử

nấm linh chi sau phá vỡ và kết hợp siêu âm
Định lượng carbohydrate, tổng chất béo có trong dịch trích ly nấm linh chi sau
phá vỡ.
Đề nghị được quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi bằng enzyme và siêu

2


Đồ án tốt nghiệp

âm, và sản xuất viên nang chứa dầu bào tử nấm Linh Chi
6.

sinense Zhao, Xu and Zhang.
Ở mỗi nơi nấm linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật
Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài
ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh
(Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung
Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại
Đông Hán) và “Ben Cao Gang Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên,
thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ.
Trong đó có hơn 250 loại nấm linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các văn bản
cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm linh chi đỏ.

4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1: Nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A)
nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)
Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây)
đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại
nấm linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm linh chi thành
rất nhiều loại khác nhau dựa vào quả thể cũng như hình dáng bên ngoài của nấm.
Ở phương Tây, theo bảng phân loại của Alexopolus năm 1979, Lingzhi thuộc
giống nấm linh chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes chi
Aphyllophorales và thuộc họ Polyporaceae. Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực vật
học người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm linh chi dựa vào lớp
biểu bì bên ngoài của nấm. Kể từ đó nấm linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu

5


• Linh chi đen: còn được gọi là nấm linh chi xuân. Loại nấm này thường mọc

6


Đồ án tốt nghiệp

ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có màu đen bên trong có màu đỏ,
thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng. Amauroderma rugosum và
Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này. Cả cuống và nắp của 2
loại nấm này đều có màu đen.
• Linh chi xanh: còn được gọi là nấm linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả thì
nấm linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá. Coriolus
versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là mũ nấm
cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn.
Trong mỗi loài nấm linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ
như nấm linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết
đến nhiều nhất. Đối với linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và
Ganoderma sinense. Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa,
người ta chỉ tập trung nghiên cứu 2 loại đó là linh chi đỏ và linh chi tím. Bảng 1.1
dưới đây mô tả đặc điểm của một số loài nấm linh chi phổ biến ở Đài Loan.

7


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1 : Đặc điểm của một số loại nấm linh chi ở Đài Loan
Tên



Kích
thước
(um)

thường

Đặc
điểm
Linh

G.

Không

applanatum có hoặc
(Pers) Pat.

rất ngắn

Xám
trắng

7Bán

thông

Cây

lá trắng, linh chi


Taiwan
Lingzhi

Màu tím, hình

G.

formosanum Có

màu tím tròn,

Chang

đen

and

hình
quả

Chen

Có thể 11.5

nấm có

quan 13

dạng

G.

Không
có hoặc
rất ngắn

Nâu đỏ, hình
nâu

tròn,

8.7Yếu

hình

10.4

Cây

lá Linh chi đỏ

X 5.2-

rộng

không cuống

7

quả


Có thể 8.5-

nguyệt, quan 11.2

Cây

hình

sát

rộng

quả

được 7

X 5.2-

lá

linh

chi

Hsiang SZU,
linh chi đỏ ở
chân đồi

thận

nấm lồi

sát

X

7- trong

được 8.5

Linh chi tre
đỏ, linh chi

Tre nứa

tre tím, linh

suốt

chi tím

thận
Tropical
Lingzhi

G.

tropicum

Nâu


6.9

loại

linh chi đỏ ở
chân đồi, cây
keo linh chi
đỏ

Hình
quả

Conifer
Lingzhi

G. Có

tsugae Murr.

Có thể

Nâu đỏ, thận,

quan 9-11

nâu tím hình

sát


microsporum hoặc

Có thể 6-8,5× Đầu

đồng,

vỏ

đen

trứng sát

rất

Cây liễu

Linh chi xanh

quan 4,5- 5 nấm
được

nhô lên
trong

ngắn
suốt
Nấm Linh Chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúc với
nước trở nên hơi mềm. Quả thể nấm linh chi gồm:
• Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm là thụ
tầng, hình ống nếu cắt ngang có dạng tổ ong. Ngoài thiên nhiên, nấm luôn có dạng

nguyên tố vi lượng, với hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Nguyễn Thị
Sáu, 2014).
Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt
bào tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu
đỏ rất mịn. Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi
sẽ chỉ thu được 1 kg bào tử.
Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về
cấu tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật,
Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.

a)

b)

Hình 1.2: a) Bào tử nấm linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần
b) Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ vách.

11


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3 Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh Chi
1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào
tử).
2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử
xẻ múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)
Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường
cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của
lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm —gai


Lignin

13 - 14%

Hợp chất nitơ

1,6 - 2,1%

Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) 1,9 - 2%
Hợp chất phenol

0,08 - 0,1%

Hợp chất Sterol toàn phần

0,11 - 0,16%

Saponin toàn phần

0,3 - 1,23%

Bảng 1.2 Thành phần dược tính của nấm Linh chi
Theo Wachtel-Galor et al. (2011) trong nấm linh chi tươi, nước là thành phần chủ
yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10- 40%, chất béo
chiếm từ 2- 8%, carbonhydrate chiếm 3- 28%, chất xơ chiếm 3- 32%, hàm lượng tro
chiếm 8- 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-xi, phốt
pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers et al.
(1999)). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al. (2001) đã
xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%),

Bản, người ta nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao
động trong khoảng từ 0- 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong
khoảng từ 1,15,8% (Lu et al. (2012)). Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính
sinh học trong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế
biến hoặc chiết xuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng
triterpenoid ít hơn khi chiết xuất bằng ethanol (Lu et al. (2012)). Bên cạnh đó, điều
kiện sinh trưởng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có

14


Đồ án tốt nghiệp

trong nấm linh chi (Lu et al. (2012)).
1.2.1 Các polysaccharide và các peptidoglycan
Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm linh chi được
xác định lần lượt từ 26- 28% và 59% (Mau et al. (2001)). Nấm linh chi có chứa rất
nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất này mang hoạt tính
sinh học và được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm linh chi. Nhiều nhóm
polysaccharide có thể được chiết xuất từ thân nấm, bào tử và khuẩn ty. Các
polysaccharide của nấm linh chi có tác dụng sinh học như chống viêm, hạ đường
huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch
(Miyazaki et al. (1981); Hikino et al. (1985); Tomoda et al. (1986); Bao et al.
(2001); Wachtel-Galor et al. (2004)). Người ta thường chiết xuất các polysaccharide
trong nấm linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủa chúng bằng dung dịch
ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết xuất bằng nước và dung dịch
kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide của nấm
linh chi (Ganoderma lucidum- polysaccharides: GL- PSs) là đường glucose (Bao et
al. (2001); Wang et al. (2002)). Ngoài ra, GL- PSs cũng có cấu trúc polymer mạch
thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết p