BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC
CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp.

Ngành

: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
TS. Nguyễn Hoàng Dũng
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Tuấn Anh

MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài:

Hồ Chí Minh. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung
thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình
thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu
trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo
danh mục tài liệu tham khảo của đồ án.
Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực
hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ
Chí Minh.
Ngày … tháng … năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tuấn Anh

i


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CÁM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải
không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của
TS. Nguyễn Hoài Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy
mà em có thể hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này. Từ tận đáy con tim, em
xin chân thành cám ơn cô Hoài Hương.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng đã mở
lòng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới
(VSHND). Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám
ơn thầy Dũng rất nhiều.
Ngoài ra, trên VSHND em còn nhận không ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh
Loan . Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luôn bên cạnh

1.1.

SÂU RĂNG .......................................................................................14

1.1.1. Bệnh học ........................................................................................14
1.1.2. Men răng ........................................................................................20
1.2.

VI KHUẨN RĂNG MIỆNG .............................................................27

1.2.1. Streptococcus spp. ..........................................................................27
1.2.2. Lactobacillus spp............................................................................29
1.2.3. Vi khuẩn lactic ...............................................................................35
1.3.

MÀNG SINH HỌC ...........................................................................36

1.3.1. Sự hình thành .................................................................................36
1.3.2. Thành phần .....................................................................................38
1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học ..........40
1.3.4. Tính chất của màng sinh học .........................................................42
1.3.5. Phân bố ...........................................................................................43
1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói
chung
........................................................................................................45
1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ............................................................47

1.4.1. Ngoài nước .....................................................................................47

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................65
3.1.

Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu............................65

3.2.

Phân lập vi khuẩn Lactic ...................................................................65

3.3.

Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh ...............67

3.4.

Định danh ..........................................................................................71

3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA .................................................................71
3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR ........................................71
3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI.
........................................................................................................72
3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn
NBG đối với L. fermentum ....................................................................................76
CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN .................................................................................82
4.1.

Kết luận .............................................................................................82

4.2.



HA

Hydroxyapatite

LBS

Lactobacillus Selection medium

LAB

Lactic acid batería

MRS

deMan, Rogosa and Sharpe

LBM

Lactobacillus biofilm medium

OD600

Opical density at 600 nm

BG

Biofilm group

NBG

hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. ...............................................75
Bảng 3.4. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và
30B2 (%) ...................................................................................................................76

vi


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng ...............15
Hình 1.2. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng ....................16
Hình 1.3. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................17
Hình 1.4. Cấu trúc của răng người ...........................................................................20
Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng ..................................................................21
Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA ........................................................................22
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. ............22
Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] ..............................23
Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod ............................................24
Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng .............................................................................24
Hình 1.11. Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod ..................................25
Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình
thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn..................................26
Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- ..........................................................26
Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp.. ........................................30
Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng
và của người mẹ. .......................................................................................................34
Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát
tán. .............................................................................................................................37
Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. ...............................................38
Hình 1.18. Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các

Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của
chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. ...73
Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 .74
Hình 3.8. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 1B. 78
Hình 3.9. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 12R2
...................................................................................................................................78
Hình 3.10. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 30B2
...................................................................................................................................79

viii


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.11. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans.........79
Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và
BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học. .............80
Hình 3.13. Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng
NBG. .........................................................................................................................81

ix


Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ
răng miệng và sức khoẻ chung. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World
Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của loài người sau bệnh ung thư và
tim mạch. Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60,
các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thông qua nghị quyết, đưa xúc tiến

Năm 2001, Tổ chức lương nông thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO)
đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật còn sống khi đưa
vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Hầu hết các vi
khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng
trong gần 1 thế kỷ qua [10]. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic
vào công cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm
sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic
[11]. Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng
tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống. Nhưng bản
chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn
chưa được thấu hiểu.
Để góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới có thể ứng dụng để phòng
ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi
Lactobacillus, nhóm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic
trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các
Lactobacillus spp. có trong mảng bám răng miệng.
2. Tình hình nghiên cứu
Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động
của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi
khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian
nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng
probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung
và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn.

11


Đồ án tốt nghiệp
Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong
sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans

Chọn ra các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh có khả năng là tác nhân
gây sâu răng. Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus.

-

Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các
Lactobacillus spp. phân lập được
5. Phương pháp nghiên cứu

-

Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình. Bên cạnh đó ghi nhận
tình trạng răng miệng của các đối tượng.

12


Đồ án tốt nghiệp
Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường LBS thông qua việc quan sát hình thái tế

-

bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử)
và các thử nghiệm sinh hóa (catalase).
Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương

-

pháp nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đó phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả năng
tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng.

-

Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài L. fermentum.

-

Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi
khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L. fermentum phân lập được và nấm
Candida albicans)
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

13


Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
SÂU RĂNG

1.1.
1.1.1.

Bệnh học

1.1.1.1. Định nghĩa
Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn

14


Đồ án tốt nghiệp
Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí
cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư).
1.1.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng
Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt
răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [21]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn
ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu.
Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong
nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng
tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [22].

Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng
Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn
thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu
có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau
nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt.

15


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng.
Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu
hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn
mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh.
1.1.1.4. Nguyên nhân


17


Đồ án tốt nghiệp
1.1.1.4.2. Nguồn carbohydrates
Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose
(đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra
quá trình khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men
đường của vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng.
Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu
răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose
là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì
vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và
fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide
bởi enzyme dextransucranase.
n sucrose  (glucose)n + n fructose
1.1.1.4.3. Thời gian
Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng.
Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH.
Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang
miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng
gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp.
1.1.1.4.4. Răng
Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy
ra khi pH môi trường đạt 5.5 [26]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì
chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [27].
Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng
của cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [28]. Nguyên nhân có thể là do
yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ

khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả
năng diệt khuẩn [32]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí
vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng.
Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn
carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những
thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây,

19


Đồ án tốt nghiệp
rau quả còn có nhiều chất sợi (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng
đường xylitol thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực
phẩm, vì vi khuẩn không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại
thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi
khuẩn phát triển.
Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời
gian mà men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp.
Nếu phải uống soda, cam chanh thì nên dùng ống hút, tránh tráng điều trong
miệng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau ăn
ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid.
Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống
sâu răng cũng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động
vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Hứa hẹn cho
một ứng dụng mới mẻ và đầy tiềm năng của probiotic.
1.1.2.

Men răng

Men răng là một trong bốn

21


Đồ án tốt nghiệp
HA kết tinh trong hệ tinh thể lục
giác

(hình

1.2).

Mỗi

tinh

thể

hydroxyapatite là một thành phần cơ
bản gồm 18 ion (hình 1.3), hình lục
giác dẹp cạnh 0,942 nm tạo góc 120o
và 60o, chiều cao (trục c) thẳng góc với
trục a và cao 0,688 nm, các đơn vị này
liên kết trồng lên nhau tạo thành cột
tinh thể hydroxyapatite [34] [35] [36].
Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C.

22


Trong đó phần thân là Rod và đuôi là Interrod [39].

Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng

24