BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC CÓ NGUỒN
GỐC TỪ THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM MANG
HOẠT TÍNH PROBIOTIC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH

: 111

GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH: NGUYỄN THỊ BÍCH THÙY
MSSV: 105111059

Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 6 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KTCN TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

KHOA: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


tháng

năm 2009

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ): ……………………………
Đơn vị:…………………………………………………
Ngày bảo vệ:……………………………………………
Điểm tổng …………………………………………….


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên con xin dành muôn vàng lời yêu thương gởi đến ba, má đã
gian lao nuôi dạy con từng ngày. Ba má luôn là chỗ dựa vững chắc nhất
của con, là người giúp con đứng vững sau những lúc vấp ngã, là nguồn
động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu hơn nữa trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể


1.3

Ứng dụng của đề tài ........................................................................................4

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng Quan Về Probiotics ..........................................................................5

2.1.1

.Lịch sử nghiên cứu Probiotics .................................................................... 5

2.1.2.

Định nghĩa về Probiotic ..............................................................................7

2.1.3.

Thành phần vi sinh của chế phẩm probiotics ............................................8

2.1.4.

Cơ chế hoạt động của probiotics. ...............................................................8

2.1.4.1. Tác động kháng khuẩn của probiotics ........................................................8
2.1.4.2. Tác động của probiotic trên biểu mô ruột ..................................................9
2.1.4.3. Tác động miễn dịch của probiotics ............................................................10
2.1.4.4. Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột ......................................10


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


2.2.4.1

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ....................................................22

2.2.4.1.1.Nhu cầu dinh dưỡng cacbon .......................................................................22
2.2.4.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ ...........................................................................22
2.2.4.1.3. Nhu cầu về vitamin ....................................................................................23
2.2.4.1.4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác ............................................................23
2.2.4.1.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác ....................................................................23
2.2.4.1.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxi .............................................................................23
2.2.4.2. Quá trình trao đổi chất ...............................................................................24
2.2.4.2.1 Lên men lactic đồng hình ............................................................................24
2.2.4.2.2 Lên men lactic dị hình ................................................................................26
2.2.5.

Sản phẩm của quá trình lên men ở vi khuẩn lactic .....................................26

2.2.5.1

Các enzyme tiêu hóa 26

2.2.5.2

Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng .......................27

2.2.5.3


2.3.1

Nhu cầu tìm kíếm các nguồn Probiotic mới............................................... 34

2.3.2.

Các tiêu chuẩn để chọn các chủng probiotics ............................................. 34

2.3.3

Các phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotic mới. ..............................35

2.3.4.

Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập ..................36

2.3.4.1

Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật .............................36

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


2.3.4.2.

Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân

tử


2.4.4.1. Trong dược phẩm .....................................................................................50
2.4.4.2

Trong thực phẩm .......................................................................................50

2.4.4.3

Trong mỹ phẩm ..........................................................................................51

2.4.4.4

Trong chăn nuôi ..........................................................................................51

2.4.4.4.1 Probiotic trong chăn nuôi heo ...................................................................51
2.4.4.4.2 Điều trị bện cho trâu bò ...............................................................................
2.4.4.4.3 Lợi ích của probiotic trong nuôi trồng thủy sản ......................................... 53
2.4.4.4.4 Lợi ích của probiotic trên các loài khác .....................................................55
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Vật liệu .......................................................................................................57

3.1.1.

Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................57

3.1.2.

Thời gian thực hiện......................................................................................57



3.2.2.2.1. Tăng sinh ....................................................................................................62
3.2.2.2.2. Phân lập.......................................................................................................62
3.2.2.3

Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ....................................63

3.2.2.3.1 Nhuộm Gram................................................................................................63
3.2.2.3.2 Nhuộm bào tử...............................................................................................63
3.2.2.3.3 Nhuộm kháng acid .......................................................................................64
3.2.2.3.4 Thử nghiệm catalaza. ...................................................................................64
3.2.2.3.5 Thử nghiệm khả năng di động. ....................................................................65
3.2.2.3.6 Thử nghiệm khả năng sinh acid. ..................................................................65
3.2.2.3.7 Thử nghiệm oxidase.....................................................................................65
3.2.2.3.8 Thử nghiệm khả năng lên men đường ........................................................66
3.2.2.3.9 Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục 67
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1

Kết quả phân lập .............................................................................................69

4.2

Thử nghiệm Catalaza...................................................................................71

4.3.

Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann ......................72

4.4.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Stt

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1:

Phân loại khoa học giống Lactobacillus

16

Bảng 2.2:

Phân loại khoa học Giống Streptococcus

18

Bảng 2.3:

Phân loại khoa học giống Leuconostoc

20

Bảng 2.4:

Phân loại khoa học giống Pediococcus

21


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


khuẩn dưới kính hiển vi x1000
Bảng 4.3:

Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn

84

Bảng 4.4:

Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 8 chủng phân

88

lập từ dược phẩm.
Bảng 4.5:

Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 7 chủng

90

phân lập từ sữa chua
Bảng 4.6:

Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli vật của 4 chủng

91

Hình 4.9: Vi khuẩn Gram dương hình cầu..................................................................74
Hình 4.10: Vi khuẩn Gram dương hình ovan .............................................................75
Hinh 4.11: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn...........................................................80
Hình 4.12: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử .....................................................81
Hình 4.13: vi khuẩn không sinh bào tử.......................................................................81
Hình 4.14: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid ........................82
Hình 4.15: Vi khuẩn bắt màu không có tính kháng acid ............................................82
Hình 4.16: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường ........................................84

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Hình 4.17: Thí nghiệm ủ E. coli với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm.................88
.

DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ
TÊN ĐỒ THỊ
Stt

Tên đồ thị

Đồ thi 4.1: Biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 8 chủng phân lập

Trang
89

từ dược phẩm
Đồ thi 4.2: Biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 7 chủng phân lập

90

25

Sơ đồ 3.1:

Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic

59

Sơ đồ 3.2:

Sơ đồ tiến hành thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật

68

bằng phương pháp đo độ đục

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

LỜI MỞ ĐẦU
Cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người, cuộc cách
mạng khoa học kỹ thuật đưa con người bước vào nền văn minh hiện đại. Khi những
nhu cầu về vật chất được đáp ứng, con người ngày càng quan tâm đến sức khỏe của

Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một
công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Với ý nghĩa đó tôi mong
muốn làm phong phú thêm nguồn vi khuẩn probiotic để đóng góp thêm vào ngành
công nghiệp probiotics những chủng vi khuẩn lactic mới từ những nguồn chứa vi
khuẩn lactic an toàn như thưc phẩm và dược phẩm, có tính kháng khuẩn cao và
những hoạt tính probiotic tốt nhất qua đồ án tốt nghiệp của tôi “Phân lập các vi
khuẩn lactic có nguồn gốc thưc phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”.

2

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề.
Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao
của con nguời. Trên phương trình thăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về
chất lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản
thân họ. Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học học
phát triển. “ Probiotics” là một phần của sự phát triển ấy.
Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life”
nghĩa là “dành cho cuộc sống”.Probiotics là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý

cấp loài.
- Kiểm tra tính kháng khuẩn của những chủng vi khuẩn lactic phân lập được
nhằm xác định những chủng có tiềm năng probiotic.

1.3 Ứng dụng của đề tài
Sử dụng những chủng vi khuẩn lactic đã phân lập có hoạt tính kháng khuẩn cao
đưa vào sản xuất probiotics ở quy mô công nghiệp.
Nhóm vi khuẩn lactic có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực chế biến thực phẩm.
Các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập, ngoài mục đích phục vụ cho đề tài này.
Chúng tôi có thể sử dụng chúng làm vi khuẩn khởi động cho các thưc phẩm lên men
ở quy mô công nghiệp hoặc nuôi cấy để tách chiết bacteriocin đối với những chủng
có khả năng sinh bacteriocin cao.

4

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng Quan Về Probiotics
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không phải
là mới. Trên hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra thuốc kháng
sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn
như các sản phẩm sữa lên men. Các bằng chứng cho thấy quá trình sản xuất sữa lên
men được ghi trong “Book of Genesis”. Theo Ayurveda, một trong số ngành y học


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

2.1.2. Định nghĩa về Probiotics
Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Tuy
nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lilly và Stillwell
(1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật
nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của định nghĩa
này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm dịch chiết
tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật [23]. Sau đó, Parker (1974) [44] đã áp dụng
khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật
chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó. Vì vậy, khái
niệm “probiotics” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân
bằng hệ vi sinh vật ruột”.
Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989) [21],
ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có
ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của
nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic
và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên
men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được
tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” [24].
Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh
thái vi sinh vật ở người trưởng thành [59]; mặc dù phương pháp trị liệu kháng sinh,
bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, nhưng
trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh ( Tannock, 2005)

vulgaris, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella
dysenteriae, Shigella paradysenteriae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
aeruginosa ,Staphylococus auerus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio comma.

2.1.4. Cơ chế hoạt động của probiotics.
2.1.4.1. Tác động kháng khuẩn của probiotics.
Probiotics làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách
cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh
tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh đồng thời tiết ra các chất
kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh. Vi khuẩn probiotic
tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, gồm có các
acid hữu cơ, hydrogen peroxide và đăc biệt là bacteriocin. Những hợp chất này có
thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn
ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được
thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ
bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.
Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn
để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có
khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng
8

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease,
lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

2.1.4.3.Tác động miễn dịch của probiotics [48].
- Probiotics như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường
ruột.
- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm.
- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng. [32], bệnh chàm [10].

2.1.4.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột
Probiotics điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những
phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn probiotic khác nhau. Khi tập
trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật
đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ
thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi
khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách
tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic
sẽ giảm xuống. Điều này đúng cho tất cả các loại probiotics.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột.
Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây
cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột.

2.1.5. Chức năng của probiotics
Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotics khác nhau có những ứng dụng cho
nhiều bệnh khác nhau.

trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố gây
bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh
tiêu chảy do kháng sinh. kết quả cho thấy chủng S. bolardii, S. boulardii,
Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng
làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị
bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả.
- Tác dụng trong trị tiêu chảy cấp : nguyên nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở
các nước đang phát triển. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lb.rhamnosus GG,
Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng rotavirus
trong hệ tiêu hóa [43]. Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em ở châu Á,
cho thấy rằng khi sử dụng Lb. rhamnosus GG có thể rút ngắn một nữa thời gian chữa
trị. Tuy nhiên, ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L. rhamnosus đã bị bất hoạt
bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L. rhamnosus sống điều này chứng tỏ
L. rhamnosus sinh ra những hợp chất có khả năng ngăn ngừa sự hoạt động của các
rotavirus
- Ngăn ngừa chứng viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi
khuẩn, virus, kí sinh trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và
Helicobacter pylori gây viêm loét và ung thư dạ dày. Chúng xâm nhập vào các tế bào
ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh
11

SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

dưỡng. Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động
trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ


SVTH: Nguyễn Thị Bích Thùy


Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM

GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic [35], [70]
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả,
làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của
vi khuẩn lactic đã được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất
kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác
dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh
trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).

2.2.1 Khái niệm.
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên
men đường để tạo acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình
dạng khác nhau: có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoạt xếp thành
chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoạt xếp thành chuỗi.
Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có dạnh hình que.
Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục
hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc
biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.

13