tên đề tài.txt
Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch Enzyme Glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus
Kawasaki trên môi trường lên men bán rắn, Ứng dụng Enzyne cố định trên chất mang
Alginate và Chitosan
(Giảng viên hướng dẫn: Cn Đỗ Thị Tuyên)
SV: Nguyễn Quốc Đạt
Lớp: 06DSH
MSSV:106111019

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu sơ lược về enzyme:
1.1.1. Khái quát chung về enzyme:
Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc
biệt xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay fecment ( ferment ). Enzyme là những
protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trò xúc tác sinh học. Dưới tác dụng của enzyme
các phản ứng hóa sinh trong cơ thể xảy ra rất nhanh không cần các điều kiện nhiệt độ,
áp suất cao và nồng độ acid hay kiềm đặc.
Enzyme có trong mọi tế bào sống, vì vậy cũng được gọi là chất xúc tác sinh học
(nhằm phân biệt với chất xúc tác có nguồn gốc từ hóa học). Trong tế bào sinh vật,
enzyme chiếm 80 % - 90 % thành phần protein tế bào.
Tuy nhiên, không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà
sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ở ngoài
tế bào (invitro).
Tóm lại, có thể nói enzyme là là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho

cầu sống của tế bào, hơn nữa các bộ phận sống trong cơ thể có số lượng enzyme không
đồng nhất. Vì vậy, chỉ có một số bộ phận mới có thể sản xuất enzyme được. Muốn thu
nhận enzyme phải phá bỏ cơ quan chiết rút. Như vậy việc dùng động vật, thực vật làm
nguồn nguyên liệu sản xuất enzyme là rất hạn chế, không kinh tế và không thể đáp ứng
nhu cầu ngày càng cao về enzyme.
Nguồn vi sinh vật được khai thác và thu nhận nhiều nhất vì ưu điểm vượt trội
sau:
 Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn.
 Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú, trong đó có những enzyme mà
động vật, thực vật không tổng hợp được.
 Vi sinh vật có cường độ sinh sản cực kỳ mạnh, hoạt tính enzyme rất cao, do vậy
chỉ cần sử dụng một lượng rất nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn.
 So với động vật và thực vật, thì việc cải tạo giống vi sinh vật dễ dàng hơn, thời
gian ngắn hơn .

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 4


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng.
 Có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để có thể thu
được hiệu suất cao trong sản xuất..
1.2. Enzyme Amylase
1.2.1. Lịch sử
Enzyme amylase hay còn gọi là diastase là enzyme sinh lý, có ý nghĩa trong

thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác sự phân giải các liên kết 0 - glucoside nội
phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước:
R-R’ + H-OH 

RH

+

R’OH

 Phương trình thủy phân tinh bột là:
( C6H12O6 ) n



n (C6H12O6)

 Hiện nay, người ta biết rõ có 6 loại enzyme amylase:
1.

-amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid

đồng loại.
2.

-amylase, thủy phân liên kết  - 1,4 - glucoside và các polysaccharid

đồng loại.
3.



Hình 1.1 :Sự thủy phân tinh bột bởi enzym amylase
1.2.4. Vi sinh vật tổng hợp amylase
Nhóm enzyme amylase, đa phần được tổng hợp bởi nấm mốc và vi khuẩn, một số ít
từ nấm men.
 Từ nấm mốc như : Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamorri, Asp. usamii;
Rhizopusneveus, Asp. patatae, Rhizopus delemar, Rhizopus javamicus; Mucor sp, và
một số loài vi sinh vật khác như: Endomycopsis fibuliger, Endomycopsis bifubuliger,
Endomymycopsis bispora; Endomyces. sp; Saccharomyces diastaticus… tạo amylase,
glucoamylase, glucozil transferase.
 Từ vi khuẩn: Bac. distaticus; Bac. subtilis; Bac. mesentercus; Bac.
amylosolvens… thường để thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt
để tách hồ tinh bột trên vải.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 7


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.2.5. Ứng dụng enzyme amylase
Chế phẩm amylase (dạng thô hay tinh khiết ) được ứng dụng khá rộng rãi trong
công nghiệp - đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Sau đây là một số ứng dụng
của nó:
 Trong công nghệ sản xuất rượu – bia
 Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose
 Trong công nghiệp nhẹ ( rũ hồ ), ngành dệt, công nghiệp giấy

người ta gọi nó là enzyme nội phân (endoamylase), trừ điểm phân nhánh trong
amylopectin để tạo thành maltose và dextrin giới hạn. Như vậy, chúng có khả năng
chuyển 80-82% tinh bột thành maltose.
 - amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột nguyên thủy mà còn thủy phân
hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ chậm.
Phản ứng thủy phân tinh bột bằng  - amylase thường xảy ra hai giai đọan:
-

Giai đoạn đầu (giai đoạn dextin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử bị thủy

phân, tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( - dextrin ) và độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh.
-

Giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa ): các dextrin phân tử thấp vừa được

tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các mantotriose, mantose, glucose và còn lại một
phần dextrin phân tử thấp không cho màu với Iốt
-

Tính chất đặc trưng của  - amylase là khả năng dextrin hóa cao, do đó làm cho

phản ứng màu của tinh bột với Iốt bị biến đổi nhanh chóng. Vì vậy, người ta gọi  amylase là  - amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
 Điều kiện hoạt động:
-

Ở 70oC,  - amylase của nấm mốc bị mất 50% hoạt lực. Trong dung dịch đệm

pH 4.7, -amylase của Asp. oryzae rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC
trong 3h, hoạt động dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29 % và hoạt lực đường hóa còn 27

 Cơ chế tác dụng:
 - amylase là một exo -  - amylase, nó xúc tác thủy phân từ đầu không khử của
mạch amylose và amylopectin và glucogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside
tạo ra maltose ( dạng  - anomeric ). Do enzym này không thủy phân được liên kết  1,6 - glucoside ở amylose nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 – 60 %
maltose dạng  - anomeric và  - detrin giới hạn, cho màu tím đỏ với iốt.
1.2.6.3. Enzyme glucoamylase (1,4 -  - D – glucan glucohydrolase
(EC.3.2.1.3)
 Tên gọi:
Glucoamylase có các tên gọi khác nhau:  - amylase, amyloglucosidase, taka amylase Bac, maltulase,  - 1,4:1,6 - glucan - 4:6 – glucohydrolase,….

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 10


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

 Tính đặc hiệu:
- Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết  - 1,4 - glucoside lẫn  - 1,6 glucoside, đồng thời cả liên kết và  -1,3 - glucoside đã đưa glucoamylase lên vị trí
hàng đầu về sự thủy phân tinh bột.
- Glucoamylase là enzyme ngoại phân
( exoenzyme ) có khả năng thủy phân khá
mạnh. Nó thủy phân hoàn toàn tinh bột,
glycogen,

amylodextrin

cuối,

CH2OH
O
H
OH
H

H

OH

_

H2O
CH2OH

OH

OH

amylase
_

H

H
O

OH

H2O


OH

H

O

OH
H

H+
O

OH

H

H

OH

H

O

OH

Hình 1.3. Enzyme glucoamylase thủy phân liên kết
 - 1,4 - glucoside và  - 1,6 – glucoside
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Sơ đồ 1.1: Khả năng thủy phân glucid của enzyme glucoamylase
Điều kiện hoạt động:
-

pH hoạt động tối thích của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không

giống nhau. Đa số các glucoamylase đã biết đều thuộc loại glucoamylase “ acid ”, thể
hiện hoạt lực ở vùng pH 3.5 – 5.5. Nếu phân loại glucoamylase theo pH tối ưu thì chỉ
gồm 2 loại là: glucoamylase “acid” và glucoamylase “ trung tính ”.
Glucoamylase “ acid” có pH tối ưu là 4.0 –5.0.
Glucoamylase “ trung tính ” có pH tối ưu là 6.0 –7,5.
Tuy nhiên, pH hoạt động tối thích của glucoamylase còn thay đổi theo nhiệt độ và
thời gian tác dụng..
-

Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase loại bền acid là 500C

-

Có lẽ glucoamylase là enzyme duy nhất có khả năng chuyển hóa hoàn toàn tinh

bột thành glucose. Tuy nhiên, khi nồng độ  - glucose trong môi trường tăng lên do sự
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 12


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến


Nguồn enzyme

tinh bột
thủy
phân

Rhizopus
delemar

Rh. delemar

Glucoamylase

92

Rh. delemar

Glucoamylase

100

Asp. awamori

Amylase “deebraanding”

100

Asp. niger


Asp. oryzae

Taka - amylase
78

Asp. awamori

Amylase - sacarogenase
80

Neurospora

Amyloglucosidase
75

Monaseus

Amyloglucosidase
74

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 14


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Các chế phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau tuy có những tính chung, song

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Tỉ phần của amylose và amylopectin trong các loại tinh bột khác nhau thì không
giống nhau. Tuy nhiên, đa phần các loại tinh bột đều gồm 20 – 30% amylose và 70 –
80 % amylopectin.


Amylose:


Cấu tạo mạch thẳng, chiều dài cực đại 7.000  gồm những đơn vị  -

glucose ( 300 – 1000 gốc ) liên kết với nhau qua liên kết 1,4 – O – glucoside tạo
xoắn theo kiểu lò xo được ổn định nhờ liên kết hydrogen nối giữa các nhóm OH tự do, mỗi vòng xoắn gồm 3 gốc glucose và có chiều dài 10,6 .


Nhưng trong dung dịch, mạch xoắn co lại, vòng xoắn lớn lên và gồm 6

gốc glucose


Amylose tạo màu xanh khi kết hợp với iốt ( I2 ).



Dễ tan trong nước ấm tạo độ nhớt không cao. M = 3 x 105 – 1 x 106.





Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.3.2. Glycogen:
Glycogen là polysaccharid, dạng dự trữ chính có ở động vật và người.
Đăc điểm :
Phân tử có cấu tạo mạch nhánh giống như amylopectin.
Các đoạn mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn amylopectin. Chiều
dài trung bình của các đọan mạch nhánh chỉ có 12 – 14 gốc glucose.
Khác với tinh bột, nó dễ tan trong nước nóng, trong nước nóng cho màu từ đỏ đến
tím, tím nâu với iốt.
Ở động vật và người, glycogen chủ yếu tập trung ở gan và hàm lượng của nó phụ
thuộc vào chế độ dinh dưỡng.
1.4 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus Kawasaki:
1.4.1 Phân loại:
Sử dụng chủng thương mại do phòng vi sinh ứng dụng viện sinh học nhiệt đới cung
cấp.
Giới: nấm
Ngành: Ascomycote
Bộ: Eurotiales
Họ: Trichocomaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus kawasaki
Nấm kawasaki là loại nấm mốc phát triển rất nhanh, khả năng tồn tại trong môi
trường cao.nhưng hiện tại rất ít được biết đến ở Việt Nam, chỉ những năm gần đây do
đặc tính tạo glucoamylase với hiệu suất cao nên đang được nghiên cứu ở các viện
nghiên cứu.

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp glucoamylase:
Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan chặt chẽ tới môi trường, các vi
sinh vật không chỉ có nhu cầu về thành phần và số lượng các chất dinh dưỡng mà còn
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… của môi
trường xung quanh. Các yếu tố này có thể kích thích hoặc ức chế sinh tổng hợp thậm
chí còn làm vi sinh vật bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản cả khi sử dụng.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 19


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.5.1 Ảnh hưởng của pH:
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị nhất định của môi trường nuôi cấy.
Thậm chí cùng một chủng vi sinh vật thì pH thích hợp cho sự sinh trưởng cũng khác
với pH cần cho sự sinh tổng hợp sản phẩm.
Trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính
acid hay kiềm làm pH của môi trường không thích hợp cho hoạt động sống. Vì vậy
việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá
trình lên men là điều cần thiết.
1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và
hiệu quả lên men, nhiệt độ cao ảnh hưởng rất mạnh và trực tiếp đối với vi sinh vật,
nhiệt độ từ 60 – 700C kéo dài trong 30phút có thể gây biến tính protein hoặc có thể làm
hệ enzyme không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt. khi hạ nhiệt độ
xuống thấp không tác động mạnh lên vi sinh vật như khi tăng nhiệt độ lên cao, tuy

Thành phần môi trường cũng cần chứa các chất khoáng như: P, S, Mn2+, K, Na…
Nếu không sẽ làm thay đổi đáng kể sự trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật nhưng chỉ
cần lượng cần thiết nhất định.
1.5.5 Ảnh hưởng của độ ẩm:
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đàu của môi trường là 35 – 60% đối với các
chủng nấm mốc như Aps. Niger, Asp.awamori, Asp.flavus, Asp.oryzae và phải giữ cho
môi trường có độ ẩm đó trong suốt thời gian nuôi cấy, tùy vào đặc tính sinh lý của từng
chủng. Độ ẩm vượt quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 40 – 55%
thì kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và tạo enzyme của nấm mốc. Khi nuôi trong
điều kiện không được vô trùng tuyệt đối, thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống
không vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dể bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ
ẩm tối ưu (phòng ngừa và hạn chế sự hỏng khô canh trường) trong suốt quá trình sinh
trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành enzyme.
Môi trường được chuẩn bị với các thông số về điều kiện nuôi cấy tương tự như
trong các thí nghiệm nêu trên.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 21


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

1.5.6 Ảnh hưởng của thời gian thu nhận:
Thời gian nuôi cấy để có lượng amylaza cực lớn được xác định bằng thực nghiệm.
Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme mà thể
ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào cần thiết. Đối với đa số nấm mốc sự
tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì như thế thường làm giảm hoạt lực

 Ưu điểm:
Phương pháp này được sử dụng phổ biến nhất trong lên men công nghiệp. Vì có
những ưu điểm sau: phương pháp lên men chim ít choáng mặt bằng, dễ cơ giới hóa và
tự động hóa trong quá trình theo dõi.
 Nhược điểm:
Tuy nhiên phương pháp này lại đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho thiết bị.
1.7 Phương pháp thu nhận enzyme từ môi trường lên men bán rắn:
1.7.1Quá trình trích ly:
Enzyme có trong tế bào vi sinh vật số lượng không nhiều so với các thành phẩn
khác. Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được không chỉ có enzyme hòa tan
trong nước mà thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất môi trường và cả chất
màu của chính nấm mốc tạo ra.
Enzyme có bản chất là protein, rất dễ bị biến tính khi bị tác động bởi các yếu tố
bên ngoài như nhiệt độ. Do đó, việc thu nhận enzyme là không dễ dàng.
Để tách chiết enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước cất hoặc các
dung dịch đệm thích hợp hoặc các muối trung tính. Trong đó, nước cất thường được sử
dụng nhất vì sự thuận tiện và kết quả của nó mang lại cao.
Enzyme từ môi trường khuếch tán vào nước do sự chênh lệch nồng độ. Nước có thể
tách từ 90 – 95% enzyme trong môi trường. nước dùng để chiết thường có nhiệt độ từ
25 – 280C.
Trong quá trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy, các vật chất khô
trong môi trường sẽ hòa tan và có tới 33 – 35% tinh bột được thủy phân hoàn toàn,
phần đường không được vi sinh vật sử dụng sẽ còn lại trong môi trường này.

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 23


Đồ án tốt nghiệp

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 24


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: CN. Đỗ Thị Tuyến

Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc: enzyme là một phức hợp protein có khả
năng tạo kết tủa với một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai
dạng thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương.
Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch.
Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết
tủa còn prtein tạp nằm trong dung dịch.
 Phương pháp tủa bằng muối: muối nồng độ cao tác dụng với phân tử nước
bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của
enzyme.
Có thể dùng các loại muối sau để tủa enzyme: (NH4)2SO4, NaCl, Na2SO4,
MgSO4… Trong công nghiệp enzyme hiện nay, người ta thường sử dụng muối
(NH4)2SO4. Ưu điểm của muối này là do muối này có mức độ hòa tan rất cao trong
nước (có thể đạt tới 720g/l, ở nhiệt độ 250C), ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí
còn có tác dụng làm bền enzyme. Một ưu điểm nữa của muối (NH4)2SO4 là khả năng
kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong
dịch chiết.
Hạn chế của phương pháp sử dụng muối (NH4)2SO4 là mất nhiều thời gian, ly tâm ở
tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước
tinh sạch khác.
 Phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ:
Thường dùng ethanol, acetone hay izopropanol…Phương pháp này hiện nay được

15%).
Cơ chế tạo kết tủa của các polymer với enzyme giống như cơ chế tạo kết tủa của
các dung môi hữu cơ với enzyme. Trong công nghiệp, thường sử dụng nồng độ
polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme.
1.8.2 Phương pháp sắc ký:
Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhất để làm sạch enzyme.
Phương pháp sắc ký đã được ứng dụng theo quy mô công nghiệp vào những năm 1960.
Nguyên tắc: chất được tách nhờ tương tác giữa hai pha (pha động và pha tĩnh). Pha
động (ở dạng lỏng hoắc khí) vận chuyển chất càn tách qua pha tĩnh (dạng rắn hoặc
lỏng) còn gọi là chất hấp phụ. Phase này có khả năng liên kết khác nhau với các thành
phần khác nhau cần tách có mặt trong phase động. các thành phần này sẽ rửa trôi ra

SVTH: Nguyễn Quốc Đạt

Trang 26