BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTIC

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110045

:

PHAN THỊ NGỌC ÁI
Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính
kháng nấm của vi khuẩn lactic” do chính tôi thực hiện.

Với khuôn khổ đồ án này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được
sự đóng góp giúp đỡ của quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, 8/2014
Sinh viên thực hiện


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH

MỤC

BẢNG

....................................................................................................iii DANH MỤC HÌNH
.....................................................................................................

iv

MỞ

ĐẦU

..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ......................................................................................... 4
1.1 Tổng quan về nấm .......................................................................................... 4
1.1.1 Giới thiệu chung ............................................................................... 4
1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra ........................................................................ 4

3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý – sinh hóa và sự thuần khiết của chủng vi
khuẩn lactic......................................................................................................... 53
3.1.1 Nhuộm Gram .................................................................................... 53
3.1.2 Nhuộm bào tử ................................................................................... 54
3.1.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann... 55
3.1.4 Kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí ................. 55
3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng.......................................................... 57
3.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính nấm ............................................... 58
3.2.1 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm không ảnh
hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic ........................................................... 59
3.2.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả
năng tăng trưởng của nấm mốc ................................................................. 60
3.3 Khảo sát khả năng kháng Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic ....... 70
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 74
4.1 Kết luận ........................................................................................................ 74
4.2 Kiến nghị ...................................................................................................... 74
PHỤ LỤC......................................................................................................................

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chủng nấm Aspergillus độc thường gặp trong thực phẩm và độc tố
vi nấm do chúng sinh ra ................................................................................................ 8
Bảng 1.2. Chủng nấm mốc Fusarium và độc tố.......................................................... 10
Bảng 1.3. Một số chủng nấm Penicillium và độc tố của chúng .................................. 12
Bảng 1.4. Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) .............. 19
Bảng 1.5. Một số hợp chất xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men....... 31

Hình 1.7. Hình dạng tế bào Pediococcus .................................................................... 22
Hình 1.8. Hình dạng tế bào Bifidobacterium .............................................................. 23
Hình 1.9. Sơ đồ tổng quan nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ...... 36
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng
nấm .............................................................................................................................. 40
Hình 2.2. Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng ..... 41
Hình 2.3. Sơ đồ chọn lọc môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh
khối vi khuẩn lactic ..................................................................................................... 44
Hình 2.4. Sơ đồ chọn lọc môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả
năng tăng trưởng của nấm mốc ................................................................................... 46
Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn
lactic ............................................................................................................................ 48
Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn ........................................... 54
Hình 3.2. Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn .......................................... 54
Hình 3.3. Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn...................................... 55
Hình 3.4. Khả năng lên men đường của vi khuẩn lactic ............................................. 56
Hình 3.5. Đồ thị biểu hiện % acid lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic sau 24
giờ nuôi cấy ................................................................................................................. 57
Hình 3.6. Đường kính (cm) nấm Mucor sp.B1 trên 4 môi trường trong 7 ngày nuôi
cấy ............................................................................................................................... 63
Hình 3.7. Đường kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 môi trường
trong 7 ngày nuôi cấy .................................................................................................. 66
4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Đường kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.Đ1 trên 4 môi trường
trong 7 ngày nuôi cấy .................................................................................................. 69
Hình 3.9. Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5

Trước thực trạng đó, đòi hỏi con người phải có hướng giải quyết kịp thời để
đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Hướng giải quyết là sử dụng các lợi khuẩn từ
vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do
đó, chúng tôi xin đề xuất đề tài “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng
nấm củavi khuẩn lactic”.
2.Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong
nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới.
1


Đồ án tốt nghiệp

Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như sản xuất chế phẩm Sadi Bio 1
(là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt
Nam. Chế phẩm Sadi Bio 1 được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc
0

nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 15 -37 C) sinh
tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza và proteinaza) có khả
năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm. Ngoài ra, sản phẩm còn
chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây
bệnh (Coliform, Salmonella). Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi
chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải.
Ngoài nước có các công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn
lactic cách ly từ Kim chi chống Aspergillus fumigatus của Jeong-Dong Kim của
viện công nghệ sinh học công nghiệp thuộc đại học Inha, Inhcheon 402-75, Hàn
Quốc.
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi
khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới.

dụng một môi trường khảo sát, môi trường MRS là môi trường
chuyên biệt biệt cho vi khuẩn lactic chứa nhiều tác nhân kháng nấm.
Do đó chúng tôi cần xác định môi trường thí nghiệm kháng nấm sao
cho vi khuẩn lactic tăng trưởng cực đại và thành phần môi trường
không ức chế sự phát triển của nấm mốc. Các thí nghiệm trong đồ án
tốt nghiệp nhằm loại bỏ một số thành phần kháng nấm trong môi
trường MRS mà vẫn giữ được khả năng tăng trưởng cao của vi khuẩn
lactic.
b. Phương pháp xử lí số liệu
-

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

-

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu

6. Kết quả đạt được của đề tài
Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm tốt từ bộ sưu
tập vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua.
Xác định được môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm tốt.
Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của chủng vi khuẩn lactic.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về nấm

quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm:
- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, M1, M2 ), ochratoxin
A, stermatocystin, axit cyclopianxoic.
- Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.
- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.
- Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether
alternarion.
- Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà
Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm
do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên
một số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức
độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động
vật và về dài lâu sẽ gây ung thư.
Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium
và Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm
Fusarium tiết, độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3 Tác hại của nấm
1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
- Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm
Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có
thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium,

Epicoccum,

Penicillium,

Fusarium..., chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số

động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể
gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm
có thể gây ung thư, đạc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà
đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép AND và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.

6


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.1

Chi Aspergillus

Hình 1.1.Nấm Aspergillus
Đã xác định trên 100 loài, phát triển rộng rãi trong thiên nhiên, nhất là những
nơi có nguồn gốc thực vật bị hư hại, thối rữa. Một số chủng thường gặp trong thực
phẩm của con người, đặc biệt là hạt ngũ cốc và hạt đậu. Nhiều loài thuộc chi
Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất trong tự nhiên, trong các sản phẩm
nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thế giới.
Một số loài, đặc biệt loài A.oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên
men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam (làm
tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin, v.v…
Hiện nay công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ
yếu là các loài A.niger, A.oryzae trong công nghiệp sản xuất enzyme (α – amylaza,
glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), trong công nghiệp chế biến thực
phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic, …
Một số loài khác có khả năng tạo thành các chất kháng sinh như A.fumigatus tạo
thành fumagilin có tác dụng trên Entamoebae histolyca, A.humicola, A.nidulans tạo

Khả năng gây
Độc cấp tính

Sản sinh độc tố

đối với gan, xơ tại 12-400C, aw
Aflatoxin B1

gan, ung thư

= 0,85-0,99

và B2

(gan), quái

(Tối ưu aw =

thai, gây ức

0,98-0,99) pH

chế miễn dịch

= 3,0-8,0.

A.flavus

nhiễm rộng
trong thực

Á

Sản sinh độc tố

Thực phẩm

tại nhiệt độ tối

bảo quản tại

0

ưu 25-30 C.

các nước

Hoại tử thận

nhiệt đới, cà


Đồ án tốt nghiệp

(đặc biệt trong

phê.

lợn), gây quái
thai, ức chế
miễn dịch.


(chuột bạch và

10-15 C, tối

chuột nhắt)

thiểu aw 0,85

0

nguồn gốc
thực vật bị
biến chất hư
hỏng; phân
hỗn hợp.
Trong hạt ngũ

A.terreus

Territrem

Gây tê liệt
(chuột nhắt)

Phát triển ưa

cốc, hạt có

nhiệt, tối thiểu


9

Ưa khô

Trong hạt ngũ
cốc có dầu


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.2 Chi Fusarium

Hình 1.2.NấmFusarium
Tác động chính là làm cho thân rễ cây khô héo, thối rữa và mục, gặp nhiều
trên cây cà phê, thông, cọ dừa, lúa mỳ, ngô và cỏ… Fusarium có thể gây ô nhiễm
trên hạt ngũ cốc và quả chín khi có lượng nước hoạt tính aw cao và tiết độc tố trước
hoặc sau ngày thu hoạch cây trồng. Độc tố gây vụ ngộ độc lớn nhất năm 1942-1948
đã làm chết 100000 người thuộc Liên bang Xô Viết, do nguyên nhân ATA (bệnh
giảm bạch cầu).
Fusarium đã tiết độc tố T-2 và trichothecenes. Hiện đã biết trên 50 loại và gần
đây năm 1988 đã phát hiện fumonisin do 4 chủng tiết là F.sporotrichioides,
F.equiseti, F.graminearum và F.moniliforme. Liều LD50 của T-2 toxin là 3-4mg/kg
TLCT chuột và lợn. Lượng độc tố fumonisin B2 trong ngô tại Nam Phi và Trung
Quốc đã gây ung thư thực quản trên người.
Bảng 1.2.Các loài nấm mốc Fusarium và độc tố (Nguồn: Vi sinh vật thực phẩm,
2003)
Loài
F.sporotrichiodes
và F.poae


Bệnh bạch cầu ức

diacetoxyscirpenol

chế đáp ứng miễn

và trichothecenes

dịch

Phổ biến trong
các loại cây trồng

khác
F.graminearum

Fumonisin

Lợn bỏ ăn rối loạn

Ngô (cùi ngô bị

sinh sản, người rối

thối rữa), lúa mì

loạn đường tiêu hóa

(thân bị thối rữa)

(P.verrucosum).
Gần đây các nhà khoa học đã thống kê có tới 32 loài đã tiết 27 độc tố vi nấm
gây độc cho động vật và người, chủ yếu tác động lên gan và thần kinh gây tê liệt cơ
thể dẫn đến chết.
Bảng 1.3. Một số loàiPenicillium và độc tố của chúng (Nguồn: Vi sinh vật thực
phầm, 2003)
Loài

Độc tố

Tác động gây độc

Thực phẩm dễ bị

tố

nhiễm

Tác động gây liệt

Trong thực phẩm

Loài gây nhiễm độc quan trọng nhất
P.crustosum

P.roqueforti

Penitrem

Roquefortin

vùng khí hậu ôn
hòa, thịt chế biến.

Loài gây nhiễm độc ít quan trọng hơn
P.citreonigrum

Ctreoviridin

Beri beri đau tim
cấp (Nhật)

Gạo bảo quản tại
Nhật và Hàn
Quốc.


Phổ b iến trong
P.citrinum

Citrinin

nhiều loại thực

Suy thận

phẩm.
Islanditoxin
P.islandicum

Gây bệnh gạo lúa

thu hoạch như sau:
- Đối với nông sản: Do nhiệt độ nông sản lúc thu hoạch cao là nguyên nhân làm
cho trao đổi chất của nông sản tăng, làm giảm sút chất lượng nhanh chóng.
Do đó, nên thu hái nông sản vào lúc có nhiệt độ thấp nhất trong ngày và
nhanh chóng đưa chúng vào nơi râm mát. Bên cạnh đó, nên thu hoạch nông
sản đúng độ chín để đạt chất lượng cảm quan và dinh dưỡng tốt nhất. Loại bỏ
các thành phần không cần thiết bị hư thối, dập nát trên rau quả và đảm bảo sự
ổn định trong quá trình vận chuyển.


- Với lượng thực như gạo, ngô, lúa mì: phải bảo quản và giữ ở nơi khô ráo,
thoáng mát để không bị nhiễm mốc.
- Với những thực phẩm thực vật như lạc, vứng, cà phê: đây là những thực phẩm
dễ hút ẩm và dễ mốc nên muốn bảo quản tốt, chúng cần được phơi khô, giữ
nguyên vỏ và được đựng trong các dụng cụ sạch kín nếu để lâu, thỉnh thoảng
phải đem phơi khô lại. Yêu cầu độ ẩm của hạt dưới 15%.
- Với nước chấm như xì dầu, tương: Cần kiểm tra vệ sinh các xí nghiệp sản xuất
nước chấm và các cửa hàng mua bán. (Kiểm tra vệ sinh môi trường (chủ yếu
là không khí). Kiểm tra vệ sinh nước chấm. Ngoài các chỉ tiêu vệ sinh đã
được qui định cho một mẫu nước chấm và một mẫu không khí, còn phải chú
ý phát hiện sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố như Aspergillus flavus,
A.parasiticus và A.fumigatus).
- Đối với hạt: Nên thu hoạch vào lúc thời tiết mát mẻ, khô ráo. Các biện pháp
bảo quản như tách hạt, phơi sấy, phân loại và làm sạch hạt, xử lý hóa chất để
ức chế hoạt động trao đổi chất của nông sản, hoạt động của dịch hại, bao gói
hợp lý.
- Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước trước khi sử dụng.
- Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ
nguyên liệu, nông sản.
- Bảo quản nguồn nguyên liệu nơi khô ráo

trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào
tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic
được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá
trình lên men carbohydrat. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid
hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Vi khuẩn lactic có thể lên men
các loại đường monosaccarit và disacarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn
lactic đều lên men được bất kỳ loại disacarit nào, một số không lên men được


saccaroza, một số không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men
được tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác.
LAB có rất nhiều hình dạng khác nhau:dạng trực khuẩn ngắn hay dạng đơn,
đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc
xếp thành chuỗi. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có dạng hình que. Đặc biệt khuẩn lạc
tỏ ra mùi chua của acid.
Khuẩn lạcvi khuẩn lactic trên môi trường thạch thường nhỏ (đường kính 2 –
5 mm), có bờ đều, láng và lồi, mờ đục không có chất màu.Lactobacilli không tạo
mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Tuy nhiên, chúng góp phần
tạo hương vị trong những thực phẩm lên men bằng cách sản xuất nhiều hợp chất dễ
bay hơi như diacetyl và những dẫn xuất của nó, thậm chí chúng tạo H2S và các amin
trong phô mai (Wood B.J.B and Holzapfel W.H. 1995).
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, acid amin,
hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn
sống được trong môi trường 10 -15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với
NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl.
Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 –
0

0

phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau,
tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển
ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa
học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương
pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại.
1.2.1.2 Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà ngưới ta chia vi khuẩn lactic thành dạng
hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.