BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

DƢƠNG THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY
ĐỘC TẾ BÀO VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN
Rhabdastrella providentiae VÀ Xestospongia muta Ở VÙNG
BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

DƢƠNG THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY

LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.TĐ.DLB.01/16-18.
Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các
thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự khâm phục và kính trọng nhất tới PGS.
TS. Phan Văn Kiệm và TS. Bùi Hữu Tài - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ
dạy cho tôi về mặt chuyên môn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án .
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Nghiên cứu cấu
trúc - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và ThS. Đan Thị Thúy
Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc
thực hiện và hoàn thiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa
sinh biển, Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học, Khoa Dược-Đại
học Wonkwang - Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình,
bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Dƣơng Thị Dung


iii

Xestospongia................................................................................................... 21
1.3.2.2. Đặc trưng phổ

13

C-NMR của một số hợp chất macrocyclic bis-

quinolizidine alkaloid phân lập từ hải miên giống Xestospongia...................25
1.3.2.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất alkaloid phân
lập từ hải miên thuộc giống Xestospongia...................................................... 29
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ................................................... 31
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu..................................................................................... 31
2.1.1. Loài hải miên Rhabdastrella providentiae................................................ 31


iv
2.1.2. Loài hải miên Xestospongia muta............................................................. 31
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 32
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất......................................................... 32
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất............................32
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học................................................ 33
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư.................. 33
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm..................................... 35
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá cơ chế chống ung thư.................................... 37
2.3. Phân lập các hợp chất..................................................................................... 38
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Rhabdastrella providentiae........38
2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Xestospongia muta.....................41
2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc................44
2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài hải miên


2.4.2.6. Hợp chất XM6: araguspongine A...................................................... 49
2.4.2.7. Hợp chất XM7: araguspongine E...................................................... 50
2.4.2.8. Hợp chất XM8: araguspongine L...................................................... 50
2.4.2.9. Hợp chất XM9: petrosin.................................................................... 50
2.4.2.10. Hợp chất XM10: petrosin A............................................................. 50
2.4.2.11. Hợp chất XM11: aragupetrosine A.................................................. 50
2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc...............................51
2.5.1. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài
Rhabdastrella providentiae.................................................................................. 51
2.5.2. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài
Xestospongia muta............................................................................................... 52
2.5.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập
từ loài Rhabdastrella providentiae...................................................................... 52
2.5.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập
từ loài Xestospongia muta................................................................................... 53
CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ............................................................... 55
3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài R. providentiae...55
3.1.1. Hợp chất RP1: rhabdastrellin G (hợp chất mới )...................................... 55
3.1.2. Hợp chất RP2: rhabdastrellin H (hợp chất mới ).....................................61
3.1.3. Hợp chất RP3: rhabdastrellin I (hợp chất mới )....................................... 63
3.1.4. Hợp chất RP4: rhabdastrellin J (hợp chất mới )....................................... 66
3.1.5. Hợp chất RP5: rhabdastrellin K (hợp chất mới )...................................... 68
3.1.6. Hợp chất RP6: rhabdaprovidine A (hợp chất mới ).................................. 69
3.1.7. Hợp chất RP7: rhabdaprovidine B (hợp chất mới )..................................71
3.1.8. Hợp chất RP8: rhabdaprovidine C (hợp chất mới )..................................73


vi
3.1.9. Hợp chất RP9: rhabdaprovidine D (hợp chất mới )..................................75
3.1.10. Hợp chất RP10: rhabdaprovidine E (hợp chất mới )..............................77

R. providentiae................................................................................................... 134


vii
3.3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài
X. muta............................................................................................................... 134
KẾT LUẬN.............................................................................................................. 140
KIẾN NGHỊ............................................................................................................. 142
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.............................................. 143
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 144
PHỤ LỤC..................................................................................................................................................... 1


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
13
C-NMR
1

H-NMR

A-549
A-2780
BV2
CD
COSY
BGC-823
Bel-7402

Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Spectroscopy
Dimethylsulfoxide
Deoxyribo Nucleic Acid
1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl
Electrospray Ionization Mass
Spectrometry
Fetal bovine serum
Human hepatocellular carcinoma
cell
Human promyelocytic leukemia
cell
Human colon carcinoma cell
Heteronuclear Mutiple Bond
Connectivity Spectroscopy
High Performance Liquid
Chromatography
High Resolution Electrospray
Ionization Mass Spectrometry
Heteronuclear Single-Quantum
Coherence Spectroscopy
Inhibitory concentration at 50%
Human epidemoid carcinoma
cell
Lipopolysaccharide

Diễn giải
Ph c ng hưởng t h t nh n
cacbon 13



ix
Kí hiệu
LU-1
MCF-7
MTT

Tiếng Anh
Human lung carcinoma cell
Human breast carcinoma cell
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide
MDAMB-435 Human breast cancer cell
L-1210
Mouse lymphocytic leukemia
cell
NOESY
Nuclear Overhauser
Enhancement Spectroscopy
PI3K/Akt
An intracellular signaling
pathway important in regulating
the cell cycle
R.
Rhabdastrella
SK-Mel-2
Human Melanoma cell
SRB
Sulforhodamine B
TLC

C-NMR của 15 hợp chất khung isomalabaricane từ các loài hải

miên giống Rhabdastrella........................................................................... 15
Bảng 1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố của một số loài hải miên giống
Xestospongia
19
Bảng 1.3. Số liệu

13

C-NMR tại các vị trí chính của các hợp chất macrocyclic bis-

quinolizidine alkaloid từ các loài hải miên giống Xestospongia................27
Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của
hợp chất RP1-RP18................................................................................... 51
Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của
các hợp chất XM1-XM11........................................................................... 52
Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất RP1-RP18............53
Bảng 2.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất XM1-XM11..........53
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của RP1.......................................................................... 56
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của RP2 và hợp chất tham khảo.....................................62
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của RP3 và hợp chất tham khảo.....................................65
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của RP4.......................................................................... 67
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của RP5 và hợp chất tham khảo.....................................68
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của RP6.......................................................................... 71
Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của RP7 và chất tham khảo............................................ 72
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của RP8 và hợp chất tham khảo.....................................74
Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của RP9.......................................................................... 77
Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của RP10 và hợp chất tham khảo.................................78
Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của RP11....................................................................... 81

Hình 1.4. Hình ảnh loài hải miên R. globostellata........................................................ 6
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất isomalabaricane........................................ 12
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các hợp chất khung macrocyclic bis 1-oxaquinolizidine hoặc bis quinolizidine alkaloid............................................. 26
Hình 2.1. Hình ảnh loài hải miên R. providentiae thu tại vùng biển Cồn Cỏ..............31
Hình 2.2. Hình ảnh loài hải miên X. muta thu tại vùng biển Vịnh Mốc......................31
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên Rhabdastrella providentiae . 40

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên Xestospongia muta..............43
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP1và hợp chất tham khảo RP1a.............55
Hình 3.2. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất RP1.............55
Hình 3.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất RP1............................................................. 57
1

Hình 3.4. Phổ H-NMR của hợp chất RP1................................................................. 58
Hình 3.5. Phổ

13

C-NMR của hợp chất RP1................................................................ 58

Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất RP1..................................................................... 59
Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất RP1.................................................................... 59
Hình 3.8. Phổ COSY của hợp chất RP1...................................................................... 60
Hình 3.9. Phổ NOESY của hợp chất RP1................................................................... 60
Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp
chất RP2 và cấu trúc hóa học của hợp chất tham khảo.............................61
Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP3 và hợp chất tham khảo....................63
Hình 3.12. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất RP3...........64
Hình 3.13. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất RP3 và phổ CD tính toán theo lý thuyết
của dạng đồng phân (22S, 23S) (3a), (22R, 23R) (3b)...............................64

Hình 3.36. Phổ H-NMR của hợp chất RP12............................................................. 86
Hình 3.37. Phổ

13

C-NMR của hợp chất RP12............................................................ 87

Hình 3.38. Phổ HSQC của hợp chất RP12................................................................. 87
Hình 3.39. Phổ HMBC của hợp chất RP12................................................................ 88
Hình 3.40. Phổ COSY của hợp chất RP12.................................................................. 88
Hình 3.41. Phổ NOESY của hợp chất RP12............................................................... 89
Hình 3.42. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
RP13.......................................................................................................... 89
Hình 3.43. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
RP14.......................................................................................................... 91
Hình 3.44. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP15....................................................... 93
Hình 3.45. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất RP15.........93


xiv
Hình 3.46. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP16....................................................... 95
Hình 3.47. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất RP16.........96
Hình 3.48. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP17....................................................... 97
Hình 3.49. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP18....................................................... 98
Hình 3.50. Cấu trúc hóa học của các hợp chất RP1-RP18....................................... 100
Hình 3.51. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) chính
của hợp chất XM1.................................................................................... 102
Hình 3.52. Các cấu dạng bền của khung 1-oxa-quinolizidine................................... 104
Hình 3.53. Các tương tác NOESY chính ở phần khung 1-oxa-quinolizidine của hợp
chất XM1................................................................................................. 104

Hình 3.68. Các tương tác NOESY chính ở phần khung 1-oxa-quinolizidine của hợp
chất XM4.................................................................................................. 114


xv
Hình 3.69. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) chính
của hợp chất XM5 và cấu trúc hóa học của các hợp chất tham khảo......116
Hình 3.70. Các tương tác NOESY chính ở phần khung 1-oxa-quinolizidine của hợp
chất XM5................................................................................................. 118
Hình 3.71. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM6......................................................................................................... 118
Hình 3.72. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM7......................................................................................................... 120
Hình 3.73. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM8......................................................................................................... 122
Hình 3.74. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM9......................................................................................................... 124
Hình 3.75. Các đồng phân lập thể phù hợp và tương tác NOESY chính của hợp chất
XM9......................................................................................................... 125
Hình 3.76. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM10....................................................................................................... 127
Hình 3.77. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất
XM11 và cấu trúc hóa học của các hợp chất tham khảo XM4 và XM10 . 129

Hình 3.78. Cấu trúc hóa học của các hợp chất XM1-XM11..................................... 132
Hình 3.79. Tác động của hợp chất XM1 đến chu kì tế bào MCF-7........................... 136
Hình 3.80. Tác động của hợp chất XM1 ở nồng độ 2 và 10µM lên hình thái tế bào
ung
thư vú người MCF-7................................................................................. 137
Hình 3.81. Tác động cùa hợp chất XM1 lên quá trình tự chết của tế bào MCF-7....138

miên ở vùng biển Việt Nam được phát hiện khoảng 160 loài và phân bố tập trung ở
vùng biển quanh c c đảo ven bờ và xa bờ. Tính đến nay mới chỉ có khoảng 20 loài
được nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học. Riêng loài hải miên
Rhabastrella providentiae chưa c nghi n cứu nào trên thế giới cũng như ở Việt Nam,
loài hải miên Xestospongia muta cũng chưa c nghi n cứu nào ở Việt Nam.
Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và ho t tính sinh học của các loài
sinh vật biển nói chung, các loài hải mi n n i ri ng đang là vấn đ thu hút sự quan tâm
của các nhà khoa học trên thế giới. T những năm 1960 đến nay trên thế giới đã c hơn
20000 hợp chất được tìm thấy có nguồn gốc t hải miên, chiếm phần lớn số lượng các
hợp chất tự nhiên có nguồn gốc t các sinh vật biển. Trong đ 5300 hợp chất được phân
lập t hải mi n được đ nh gi là có ho t tính. Ở Việt Nam, bước đầu đã c những
công trình nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của các loài sinh vật
biển đăng tr n c c t p chí quốc tế uy tín nhưng chưa nhi u. Chính vì thế nhiệm vụ


2
nghiên cứu khảo sát v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của hải miên nói riêng
và sinh vật biển nói chung ở nước ta là rất quan trọng. Xuất phát t điểm đ đ
tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm của
hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia muta ở vùng biển
Trung bộ Việt Nam” đã được lựa chọn.
Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hai loài hải
miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia muta thu ở vùng biển Trung b Việt
Nam. Đ nh gi ho t tính g y đ c tế bào và ho t tính kháng viêm in vitro của các hợp chất
phân lập được để tìm kiếm các ho t chất làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu
tiếp theo để t o ra sản phẩm chăm s c sức khỏe cho c ng đồng.
Nội dung luận án bao gồm:
1. Phân lập các hợp chất t hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia
muta thu ở vùng biển Trung b Việt Nam bằng c c phương ph p sắc ký;
2. X c đ nh cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng c c phương ph p vật


Hình 1.1. Hải miên thuộc lớp Hexactinellida


4
- Lớp Calcarea có b khung cơ thể t o bởi Ca, m t d ng CaCO3, có thể t o thành các
nhánh riêng biệt hoặc thành m ng lưới lớn. Tất cả các tế bào có m t nhân và màng.

Hình 1.2. Hải miên thuộc lớp Calcarea
- Lớp Demospongiae hầu hết có các nhánh silicat hoặc sợi xốp hoặc h n hợp cả hai
trong các mô m m của chúng. Tuy nhiên, m t số loài có chứa cơ quan ngoài được t o
nên bởi aragnoit, m t d ng canxi carbonat khác. Tất cả các tế bào có m t nhân và màng.

Hình 1.3. Hải miên thuộc lớp Demospongiae
- Lớp Archeocyatha chỉ được biết đến qua các hóa th ch t

thời Cambri.

Các kết quả nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học t các loài hải
mi n đã cho thấy sự đa d ng và phong phú. Đ y là nguồn cung cấp các ho t chất kh ng
lồ và được nhi u nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu đặc biệt là các nhà
khoa học ở c c nước phát triển. Các thống kê cho thấy hải miên là nguồn cung cấp chủ
yếu các hợp chất thứ cấp t sinh vật biển. Chỉ tính ri ng năm 2008 c tới 75% các hợp
chất được phân lập t sinh vật biển có nguồn gốc t hải miên [2]. T năm những 1960 đến
nay trên thế giới đã c hơn 20000 hợp chất được tìm thấy có nguồn


5
gốc t hải mi n ước tính trung bình khoảng 300 hợp chất mới được phát hiện và phân
lập t hải miên m i năm [2, 3]. Cơ sở dữ liệu MarinLit năm 2010 cho thấy m t số

isomalabaricane lo i nortriterpenoid và triterpenoid. C c hợp chất này đã được chứng
minh là thể hiện nhi u ho t tính như g y đ c tế bào ung thư kh ng vi m, kh ng khuẩn [79].


6

Hình 1.4. Hình ảnh loài hải miên R. globostellata
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về hải miên giống Rhabdastrella trên thế giới
Hiện trong nước chưa c công bố nào v thành phần hóa học cũng như ho t tính
sinh học của hải miên thu c giống Rhabdastrella. Tính đến năm 2017 tr n thế giới đã
có khoảng 20 công trình công bố, các nhà khoa học ở c c nước trên thế giới đã ph n
lập và x c đ nh cấu trúc của hơn 80 hợp chất t

loài R. globostellata và loài R. aff.

distincta. Đi u đặc biệt, các hợp chất phân lập được chủ yếu có cấu trúc hóa học d ng
khung isomalabaricane. Các hợp chất này

có thể thu c lo i isomalabaricane

triterpenoid (30C), lo i isomalabaricane nor-triterpenoid (29C) hay là c c hợp chất c số
carbon ít hơn nữa hình thành do sự đứt gãy của m nh nhánh t o n n c c hợp chất được
gọi chung là isomalabaricane analog. Cấu trúc các hợp chất thay đ i đ ng kể theo v trí
sinh thái nơi sống của các loài hải miên này.
Các hợp chất isomalabaricane được gọi chung cho các triterpenoid ba vòng
ngưng tụ được sắp xếp d ng trans-syn-trans 6,6,5-tricyclic terpenoid, mới chỉ được
thông báo tìm thấy t các loài hải miên thu c giống Stelletta, Jaspis, Geodia và
Rhabdastrella (thu c họ Astrophorida). Nhi u hợp chất triterpenoid isomalabaricane đã
được tìm thấy có ho t tính g y đ c đ ng kể đối với các dòng tế bào ung thư ở người
[10].