BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐỖ ĐỨC QUẾ

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA NẤM TÚI HỌ XYLARIACEAE Ở MƯỜNG PHĂNG
- ĐIỆN BIÊN VÀ CÚC PHƯƠNG - NINH BÌNH
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62.42.01.07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. VƯƠNG TRỌNG HÀO
2. TS. DƯƠNG MINH LAM

HÀ NỘI - 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận án

Đỗ Đức Quế


LỜI CẢM ƠN

Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ đề
tài mã số 106.07-2011.57 kinh phí cho tôi thực hiện một phần nội dung trong
luận án này.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã dành tình yêu thương,
ủng hộ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án.
Hà Nội, Ngày … tháng … năm 2014
NGHIÊN CỨU SINH

Đỗ Đức Quế

Deleted: 20
Deleted: 02


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Diễn giải

bp

base pair (cặp bazơ)

Cd

Concentration of dominance ( chỉ số mức độ chiếm ưu thế)

cs

cộng sự

Human immunodeficiency virus (vi rút gây suy giảm miễn dịch ở

người) HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) ITS
IU

Internal transcribed spacer

International unit (đơn vị quốc tế)

Lu

Human lung carcinoma (ung thư phổi ở người)

MCF7

Human breast carcinoma (ung thư vú ở người)

MHA
MHB

Mueller-Hinton Agar (môi trường MHA)
Mueller-Hinton Broth (môi trường MHB) MTT
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

NCBI



PDA

Potato dextrose agar (môi trường PDA) SI

Index of similarity hay Sorensen’s Index STT
Số thứ tự
TAE

Tris acetic acid EDTA buffer (dung dịch đệm TAE) Taxon

Đơn vị phân loại bao gồm (loài, thứ, loài chưa định tên) TCA
Trichloroacetic acid
TE

Tris EDTA buffer (dung dịch đệm TE)

TSA

Tryptic Soy Agar (môi trường TSA) TSB
Tryptic Soy Broth (môi trường TSB)

RNS
VQG

Rừng nguyên sinh
Vườn quốc gia


MỤC LỤC

1.2.2. Ở Việt Nam................................................................................................36
1.3. Đặc điểm khu vực nghiên cứu .......................................................................41
1.3.1. Rừng nguyên sinh Mường Phăng ..............................................................41
1.3.2. Vườn Quốc gia Cúc Phương .....................................................................43


Chương 2: ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU.......................................................................................................45
2.1. Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu ..................................................45
2.1.1. Địa điểm và sinh cảnh của KVNC .............................................................45
2.1.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................45
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................48
2.1.3.1. Mẫu nghiên cứu .................................................................................48
2.1.3.2. Các dòng tế bào..................................................................................48
2.1.3.3. Vi sinh vật..........................................................................................48
2.1.3.4. Hóa chất .............................................................................................48
2.1.3.5. Thiết bị...............................................................................................49
2.1.3.6. Môi trường .........................................................................................50
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................50
2.2.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................50
2.2.1.1. Thu thập và xử lý mẫu .......................................................................50
2.2.1.2. Phương pháp phân lập nấm ................................................................51
2.2.1.3. Bảo quản các chủng nấm phân lập được ............................................51
2.2.1.4. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái, định loại mẫu.................52
2.2.1.5. Hoạt tnh kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất hóa học ...............53
2.2.1.6. Hoạt tnh gây độc tế bào của các hợp chất hóa học ............................54
2.2.2. Sinh học phân tử........................................................................................55
2.2.2.1. Tách chiết ADN .................................................................................55
2.2.2.2. Phản ứng PCR....................................................................................56
2.2.2.3. Phân tch trình tự ADN ......................................................................56

...................................................70
3.1.4. Trình tự mới cho khoa học .........................Error! Bookmark not defined.
3.2. Đa dạng sinh học nấm túi họ Xylariaceae ở KVNC.....................................74
3.2.1. Đa dạng về thành phần loài
......................................................................74
3.2.2. Đa dạng sinh học loài ...............................................................................79
3.2.3. Đa dạng sinh học theo KVNC ...................................................................81
3.2.4. Đa dạng theo mùa
.....................................................................................84
3.2.5. Đa dạng về các yếu tố địa lý của nấm họ Xylariaceae ở KVNC ................85
3.2.5.1. Các loài phân bố toàn cầu
..................................................................86
3.2.5.2. Các loài nhiệt đới
...............................................................................87

3.2
.5.
3.
Các
loài
ôn
đới
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....

3.3.2. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Annulohypoxylon.............95

Deleted: 71


3.3.3. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Biscogniauxia..................98
3.3.4. Mối quan hệ di truyền của các taxon thuộc chi Daldinia ........................100
3.3.5. Mối quan hệ di truyền của các taxon thuộc chi Hypoxylon .....................102
3.3.6. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Kretzschmaria ...............105
3.3.7. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Nemania ........................107
3.3.8. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Rosellinia ......................109
3.3.9. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Xylaria ..........................110
3.4. Cấu trúc hóa học và hoạt tnh sinh học của các hợp chất được tách từ
thể quả ở một số loài nấm túi họ Xylariaceae ...................................................115
3.4.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thu được từ thể quả nấm túi họ
Xylariaceae .......................................................................................................115
3.4.1.1. Loài Biscogniauxia philippinensis ...................................................115
3.4.1.2. Loài Daldinia concentrica ...............................................................116
3.4.1.3. Loài Xylaria atrosphaerica ..............................................................116
3.4.1.4. Loài Xylaria schweinitzii .................................................................117
3.4.2. Hoạt tính sinh học của các chất hóa học tách từ thể quả ........................118
3.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ..................................................................118
3.4.2.2. Hoạt tnh kháng khuẩn .....................................................................119
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................123
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................124
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 1 PL


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Đặc điểm hình thái chất nền đặc trưng của họ Xylariaceae ...............8

Hình 1.2:

Một số dạng thể quả đặc trưng của họ Xylariaceae ...........................9

Hình 1.3 :

Các dạng lỗ miệng đặc trưng của họ Xylariaceae ............................10

Hình 1.4:

Đặc điểm hình thái túi bào tử đặc trưng của họ Xylariaceae ...........11

Hình 1.5:

Đặc điểm hình thái đỉnh túi bào tử của họ Xylariaceae ....................12

Hình 1.6:

Đặc điểm hình thái bào tử và rãnh mầm của bào tử đặc trưng
của họ Xylariaceae ...........................................................................13

Hình 1.7:

Một số dạng cuống sinh bào tử của họ Xylariaceae .........................14



Hình dạng túi bào tử trong họ Xylariaceae .......................................63

Hình 3.5:

Một số hình thái bào tử trong họ Xylariaceae ...................................64

Hình 3.6:

Cấu trúc bên trong chất nền loài Daldinia concentrica MP365 ........84

Hình 3.7:

Mối quan hệ di truyền của 49 taxon trong họ Xylariaceae ở
KVNC dựa trên trình tự ITS rADN. ...................................................92

Hình 3.8:

Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Annulohypoxylon
dựa trên trình tự ITS rADN. ..............................................................96

Hình 3.9:

Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Biscogniauxia
dựa trên trình tự ITS rADN. ..............................................................99

Hình 3.10:

Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Daldinia dựa trên
trình tự ITS rADN. ...........................................................................101

Hình 3.16:

Cấu trúc các hợp chất thu được từ thể quả loài B. philippinensis ...115

Hình 3.17:

Cấu trúc các hợp chất thu được từ thể quả loài D. concentrica ......116

Hình 3.18:

Cấu trúc các hợp chất thu được từ thể quả loài X. atrosphaerica ...117

Hình 3.19:

Cấu trúc các hợp chất thu được từ thể quả loài X. schweinitzii ......117


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có hệ
thực vật, động vật vô cùng phong phú, đa dạng và độc đáo. Do tác động của
tự nhiên cũng như của con người nên hệ động, thực vật luôn có sự biến đổi
theo thời gian. Vì vậy, nghiên cứu cơ bản về đa dạng sinh học là cơ sở khoa
học cho các lĩnh vực khoa học khác như Sinh thái, Sinh lý thực vật, Địa lý thực
vật, Tài nguyên thực vật, công nghệ sinh học, Hóa học, Y học, Dược học [133,

Deleted: 133
Deleted: 158

nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất mới có hoạt tính sinh học rất hữu
ích như hoạt chất chống ung thư, chống nấm, chống virut, chống viêm [121,
158].
RNS Mường Phăng – Điện Biên và VQG Cúc Phương – Ninh Bình là 2
khu rừng được bảo tồn rất nghiêm ngặt. Mặc dù hai địa điểm này cùng nằm
trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nhưng do dãy Hoàng Liên Sơn ngăn

Deleted: 121
Deleted: 158
Formatted:

Vietnamese

Deleted: ừng nguyên sinh
Formatted:

Vietnamese

Deleted: ườn quốc gia


cách nên giữa Mường Phăng và Cúc Phương có sự khác biệt khá lớn không
chỉ về khí hậu mà cả địa chất. Tuy mức độ đa dạng nấm cao nhưng có rất ít
các công bố về đa dạng nấm túi họ Xylariaceae ở đây. Những kết quả
thu được vẫn chưa thể hiện được sự đa dạng cũng như ý nghĩa của nấm túi
họ Xylariaceae tại 2 vùng trên [7, 14, 71].
Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “
Nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở
Mường Phăng - Điện Biên và Cúc Phương – Ninh Bình”. Việc nghiên cứu
sẽ góp phần bổ sung danh lục các loài nấm ở Việt Nam cũng như gợi ra hướng


Formatted:

Vietnamese

Deleted: ườn Quốc gia


3

Phương – Ninh Bình.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài cung cấp chính xác và đầy đủ danh lục các loài nấm túi họ
Xylariaceae cũng như các đặc điểm định loại và phân bố của chúng ở KVNC,
từ đó góp phần bổ sung thêm kiến thức cho ngành phân loại nấm, tạo sự hiểu
biết sâu sắc hơn về phân loại nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam.
Cung cấp các dữ liệu về trình tự ADN cho khoa học, đồng thời bổ sung
các loài nấm mới ghi nhận cho khu hệ nấm ở Việt Nam.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho các ngành hóa
học, y – dược, sinh thái, tài nguyên sinh vật và đa dạng sinh học.
Cung cấp những dữ liệu về đặc điểm hình thái, tnh đa dạng sinh
học khóa định loại các loài nấm túi họ Xylariaceae để phục vụ cho công tác
giảng dạy, nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen sinh vật ở Việt Nam.
6. Những đóng góp mới

Formatted: Vietnamese

- Đây là luận án đầu tiên nghiên cứu có tnh hệ thống về nấm túi họ


Formatted:

Vietnamese

Formatted: Vietnamese


5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí nấm túi họ Xylariaceae trong hệ thống phân loại và đặc điểm
hình thái của chúng
1.1.1. Vị trí họ Xylariaceae trong hệ thống phân loại nấm
Kết quả thống kê hiện nay, nấm túi là ngành có số lượng loài lớn nhất
trong giới nấm, chiếm tới hơn 50% tổng số loài nấm hiện biết với 68 bộ, 327
họ, 6355 chi, 79262 loài [77, 78, 182]. Nấm túi họ Xylariaceae ban đầu được

Deleted: 77
Deleted: 78

xếp vào họ Clavariaceae với loài đặc trưng là Clavaria hypoxylon (Sau này là
loài Xylaria hypoxylon). Tuy nhiên, Tulasne và Tulasne (1863) nhận thấy một
số loài có nhiều đặc điểm khác biệt về hình thái bên ngoài nên đã tách từ họ
Clavariaceae ra thành một họ mới, ban đầu lấy tên là “Xylariei”. Những kết
quả nghiên cứu sau này về cả đặc điểm hình thái lẫn cấu trúc hiển vi đã
xác định Xylariaceae là họ độc lập và có số lượng loài rất đa dạng [158].
Mặc dù hệ thống phân loại nấm túi đã dần được hoàn thiện, tuy
nhiên vẫn còn rất nhiều tranh cãi và bàn luận, các nhà khoa học dựa trên các
quan điểm khác nhau đã đưa ra những nhận định cũng như hệ thống phân

Các lớp trong ngành

Các bộ trong lớp

Các họ trong

Deleted: 78

nấm túi Ascomycota

Sordariomycetes

Bộ Xylariales

Deleted: 78

1. Ngành Ascomycota

1. Lớp Arthoniomycetes

1. Bộ Boliniales

1. Họ Amphisphaeriaceae

2. Ngành Basidiomycota

2. Lớp Dothideomycetes

2. Bộ Calosphaeriales


6. Bộ Diaporthales

6. Họ Hyponectriaceae

7. Ngành Neocallimastigomycota

7. Lớp Lichinomycetes

7. Bộ Hypocreales

7. Họ Iodosphaeriaceae

8. Ngành Zygomycota

8. Lớp Neolectomycetes

8. Bộ Lulworthiales

8. Họ Myelospermataceae

9. Lớp Orbiliomycetes

9. Bộ Melanosporales

9. Họ Xylariaceae

10. Lớp Pezizomycetes

10. Bộ Microascales


dạng về hình dạng, màu sắc và kích thước. Vì vậy, đặc điểm hình thái là cơ
sở quan trọng trong nghiên cứu định loại cũng như trong nghiên cứu ứng
dụng.
1.1.2.1. Chất nền (Stromata)
Chất nền là một đặc điểm hình thái có thể quan sát bằng mắt
thường. Hiện nay, các nhà khoa học vẫn coi đây là một chỉ tiêu quan trọng
để định loại đến loài. Chất nền có rất nhiều hình dạng, màu sắc và kích
thước khác nhau. Điều này cũng chứng minh được khả năng thích nghi rộng
của nấm túi họ Xylariaceae trên toàn cầu [56, 136, 162].
Chất nền có dạng phẳng, dẹt (applanata) phổ biến nhất là ở các
chi Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Hypoxylon, Nemania (Hình 1.1 B, C);
hoặc các dạng khác như: dạng ụ (effused-pulvinate) thường gặp ở các chi
Annulohypoxylon, Kretzschmaria (Hình 1.1. F); dạng cầu (spherical) có cuống
hoặc không cuống ở các chi Daldinia, Rosellinia hay Xylaria. Ngoài ra, các chi
Xylaria, Kretzschmaria có chất nền hình chùy (clavate) hoặc hình trụ
(cylindrical) (Hình 1.1 I, J, L).
Chất nền của nấm túi họ Xylariaceae thường có màu đen, tuy
nhiên cũng có rất nhiều loài trong một chi có màu sắc khác nhau như
màu vàng, màu nâu, màu trắng.
Kích thước chất nền của các loài trong họ Xylariaceae khác nhau
nhiều, từ một vài milimét (mm) cho tới hàng chục xentimét (cm) (Xylaria
allantoidea có chiều dài chất nền tới 15 cm, trong khi đó chất nền của X.
heliscus chỉ đạt 3 mm).


8

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái chất nền đặc trưng của họ Xylariaceae [147]
A. Daldinia eschscholzii, B. Biscogniauxia capnodes, C. Hypoxylon
monticulosum, D. Rhopalostroma lekae, E. Kretzschmaria clavus, F.

Annulohypoxylon, Hypoxylon, Biscogniauxia, Rosellinia, Kretzschmaria. Riêng
chi Annulohypoxylon, lỗ miệng có một vùng phẳng hình đĩa bao quanh.
Dạng
2: lỗ miệng bằng bề mặt chất nền, dạng này có thể gặp ở một số loài
chi
Biscogniauxia, Hypoxylon. Dạng 3: lỗ miệng thấp hơn bề mặt chất nền

Field Code Changed


Biscogniauxia citriformis (Hình 1.3 c). Lỗ miệng cũng là một chỉ tiêu định loại
nấm túi, đặc biệt là phân biệt các loài chi Annulohypoxylon và Hypoxylon [55].

Deleted: 55
Deleted: 55
Deleted: 55

Hình 1.3 : Các dạng lỗ miệng đặc trưng của họ Xylariaceae [55]
A-C: lỗ miệng dạng phẳng; D-F: lỗ miệng dạng nhú cao hơn bề mặt chất nền; G-I:
lỗ miệng có nhú thấp hơn bề mặt chất nền.
A. H. rubiginosum. B. H. fragiforme. C. H. placentiforme. D. H. monticulosum.
E. H. multiforme. F. H. annulatum. G. H. stygium. H. H. nitens. I. H. bovei.

1.1.2.4. Túi bào tử (Asci)
Túi bào tử là cơ quan sinh sản, đảm nhiệm chức năng lưu giữ và
bảo vệ các bào tử. Túi bào tử có thể hình chùy và phổ biến nhất là
hình trụ (Hình 1.4). Trong mỗi túi luôn có 8 bào tử. Túi bào tử ở
Xylariaceae có một lớp vỏ, trong suốt, thường có cuống nhỏ, vỏ mỏng.
Một số ít có dạng hình thoi, gặp ở một số loài trong chi Rosellinia.
Túi bào tử cũng là chỉ tiêu quan trọng trong định loại nấm túi đặc