BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
YZ ĐỖ ĐỨC QUẾ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA NẤM TÚI HỌ XYLARIACEAE Ở MƯỜNG PHĂNG
- ĐIỆN BIÊN VÀ CÚC PHƯƠNG - NINH BÌNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


kinh phí cho tôi thực hiện đề tài.
GS.TS. Nguyễn Thành Đạt, GS.TS. Phạm Thị Thùy, GS.TSKH. Trịnh
Tam Kiệt, PGS.TS. Đặng Ngọc Quang, TS. Trần Thị Thúy, TS. Phan Duệ
Thanh, TS. Đoàn Văn Thược những người thầy đã truyền
đạt kiến thức cho
tôi về lĩnh vực Vi sinh vật, Nấm học, Hợp chất thiên nhiên. Đồng thời các
thầy tham gia góp ý cho tôi từ xây dựng đề cương đến quá trình thực hiện
luận án và giúp đỡ tôi hoàn thành các chuyên đề tiến sĩ, cũng như các seminar
khoa học ở Bộ môn.
Ths. Tống Thị Mơ, Ths. Trần Hữu Phong, CN. Phạm Thị Hồng Hoa,
CN. Phạm Thị Vân đã tạo điều kiện thực nghiệ
m tốt nhất và hỗ trợ kỹ thuật
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Ban quản lý rừng nguyên sinh Mường Phăng – Điện Biên và vườn
quốc gia Cúc Phương - Ninh Bình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành
thu mẫu.
Ban lãnh đạo Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Phú Thọ, Ban Giám hiệu và
tập thể giáo viên trường THPT Thạch Kiệt đã tạo mọi điều kiện v
ề kinh phí,
thời gian và luôn động viên khích lệ tôi trong quá trình học tập.
Ban Giám Hiệu, Phòng quản lý Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh
học Trường ĐHSP Hà Nội đã động viên và tạo những điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ đề
tài mã số 106.07-2011.57
kinh phí cho tôi thực hiện một phần nội dung trong
luận án này.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã dành tình yêu thương,
ủng hộ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án.
Hà Nội, Ngày …

MHA Mueller-Hinton Agar (môi trường MHA)
MHB Mueller-Hinton Broth (môi trường MHB)
MTT Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide
NCBI National Center for Biotechnology Information
NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)
kb kilo base

kda kilo dalton
KB Human epidermic carcinoma (ung thư biểu mô ở người)

KVNC Khu vực nghiên cứu
OD Optical density (mật độ quang)
PCR Polymerase chain reaction
PDA Potato dextrose agar (môi trường PDA)
SI Index of similarity hay Sorensen’s Index
STT Số thứ tự
TAE Tris acetic acid EDTA buffer (dung dịch đệm TAE)
Taxon Đơn vị phân loại bao gồm (loài, thứ, loài chưa định tên)
TCA Trichloroacetic acid
TE Tris EDTA buffer (dung dịch đệm TE)
TSA Tryptic Soy Agar (môi trường TSA)
TSB Tryptic Soy Broth (môi trường TSB)
RNS Rừng nguyên sinh
VQG Vườn quốc gia
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2

2.1.2. Thời gian nghiên cứu 45
2.1.3. Vật liệu nghiên cứu 48
2.1.3.1. Mẫu nghiên cứu 48
2.1.3.2. Các dòng tế bào 48
2.1.3.3. Vi sinh vật 48
2.1.3.4. Hóa chất 48
2.1.3.5. Thiết bị 49
2.1.3.6. Môi trường 50
2.2. Phương pháp nghiên cứu 50
2.2.1. Phương pháp vi sinh 50
2.2.1.1. Thu thập và xử
lý mẫu 50
2.2.1.2. Phương pháp phân lập nấm 51
2.2.1.3. Bảo quản các chủng nấm phân lập được 51
2.2.1.4. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái, định loại mẫu 52
2.2.1.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất hóa học 53
2.2.1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất hóa học 54
2.2.2. Sinh học phân tử 55
2.2.2.1. Tách chiết ADN 55
2.2.2.2. Phản ứng PCR 56
2.2.2.3. Phân tích trình tự ADN 56
2.2.3. Phương pháp hóa sinh 57
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết các chất 57
2.2.3.2. Phương pháp xác đị
nh cấu trúc hóa học 57
2.2.4. Phương pháp toán học 57
2.2.4.1. Độ phong phú loài 57
2.2.4.2. Chỉ số đa dạng sinh học loài H’ (Shannon and Weiner’s Index) 58
2.2.4.3. Chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson,
(Concentration of Dominance-Cd) 58

3.3.5. Mối quan hệ di truyền của các taxon thuộc chi Hypoxylon 102
3.3.6. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Kretzschmaria 105
3.3.7. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Nemania 107
3.3.8. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Rosellinia 109
3.3.9. Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Xylaria 110
3.4. Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất được tách từ
thể quả ở mộ
t số loài nấm túi họ Xylariaceae 115
3.4.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thu được từ thể quả nấm túi họ
Xylariaceae 115
3.4.1.1. Loài Biscogniauxia philippinensis 115
3.4.1.2. Loài Daldinia concentrica 116
3.4.1.3. Loài Xylaria atrosphaerica 116
3.4.1.4. Loài Xylaria schweinitzii 117
3.4.2. Hoạt tính sinh học của các chất hóa học tách từ thể quả 118
3.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào 118
3.4.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn 119
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123
TÀI LIỆU THAM KHẢO 124
PHỤ LỤC
1 PL
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của nấm họ Xylariaceae trong hệ thống phân loại
nấm hiện nay 6
Bảng 1.2: Danh sách các chi trong họ Xylariaceae đến năm 1996 17

Hình 1.6: Đặc điểm hình thái bào tử và rãnh mầm của bào tử
đặc trưng
của
họ Xylariaceae 13
Hình 1.7: Một số dạng cuống sinh bào tử của họ Xylariaceae 14
Hình 1.8: Cấu trúc hợp chất azaphilone tách từ Hypoxylon 29
Hình 1.9: Nhóm hợp chất cytochalasin được tách từ chi Daldinia và Xylaria 30
Hình 2.1: Bản đồ thu mẫu tại VQG
Cúc Phương 46
Hình 2.2: Bản đồ thu mẫu tại RNS Mường Phăng 47
Hình 3.1: Một số hình dạng và màu sắc của chất nền trong họ Xylariaceae 60
Hình 3.2: Một số hình dạng thể quả trong họ Xylariaceae 61
Hình 3.3: Một số dạng lỗ miệng trong họ Xylariaceae 62
Hình 3.4: Hình dạng túi bào tử trong họ Xylariaceae 63
Hình 3.5: Một số hình thái bào tử trong họ Xylariaceae 64
Hình 3.6: Cấu trúc bên trong chất nền loài Daldinia concentrica MP365 84
Hình 3.7: Mối quan hệ di truyền của 49 taxon trong họ Xylariaceae ở
KVNC dựa trên trình tự ITS rADN. 92
Hình 3.8: Mối quan hệ di truyền c
ủa các taxon trong chi Annulohypoxylon
dựa trên trình tự ITS rADN. 96
Hình 3.9: Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Biscogniauxia
dựa trên trình tự ITS rADN. 99
Hình 3.10: Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Daldinia dựa trên
trình tự ITS rADN 101
Deleted: vườn Quốc gia
Deleted: rừng nguyên sinh
Hình 3.11: Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Hypoxylon dựa
trên trình tự ITS rADN 103
Hình 3.12: Mối quan hệ di truyền của các taxon trong chi Kretzschmaria 1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có hệ
thực vật, động vật vô cùng phong phú, đa dạng và độc đáo. Do tác động của tự
nhiên cũng như của con người nên hệ động, thực vật luôn có sự biến đổi theo
thời gian. Vì vậy, nghiên cứu cơ bản về đa dạng sinh học là cơ sở khoa học cho
các lĩnh vực khoa học khác như
Sinh thái, Sinh lý thực vật, Địa lý thực vật, Tài
nguyên thực vật, công nghệ sinh học, Hóa học, Y học, Dược học [133
, 158].
Nấm là một giới sinh vật quan trọng trên trái đất không chỉ vì vai trò của
chúng trong các hệ sinh thái mà còn bởi vai trò to lớn của chúng đối với đời
sống con người [98
]. Các nhà khoa học ước tính có khoảng 1.5 triệu loài nấm
trên trái đất, tuy nhiên số lượng loài thực tế mà chúng ta đã tìm thấy khoảng
100.000 loài, đạt khoảng gần 6,7% so với số loài ước tính [44
, 99, 138].
Xylariaceae là họ có số lượng loài lớn nhất trong ngành nấm túi. Cho
đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 95 chi với 1354 loài được công
bố trên toàn thế giới [182]. Riêng khu vực Đông Nam Á, các nhà khoa học đã
ghi nhận ở Thái lan có 154 loài thuộc 23 chi, ở Đài Loạn có 136 loài thuộc 17
chi [56
, 173]. Tuy nhiên, ở nước ta vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu
đầy đủ về họ này mà mới chỉ thống kê được 69 loài thuộc 13 chi [1, 2, 3, 4,

Xylariaceae tại 2 vùng trên [7, 14, 71].
Từ nh
ững lí do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên
cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở Mường
Phăng - Điện Biên và Cúc Phương – Ninh Bình”. Việc nghiên cứu sẽ góp
phần bổ sung danh lục các loài nấm ở Việt Nam cũng như gợi ra hướng nghiên
cứu ứng dụng của nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam.
2. Mục đích của đề
tài
Xác định được
thành phần loài và đánh giá đa dạng sinh học của nấm
túi họ Xylariaceae tại KVNC.
Nghiên cứu được
một số đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại
KVNC.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Xác định thành phần loài nấm túi họ Xylariaceae tại KVNC
- Định loại đến chi, đến loài các mẫu nấm đã được miêu tả dựa vào đặc
điểm hình thái và phân tích trình tự ITS
3.2. Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại KVNC
3.3. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các chi, các loài nấm túi họ
Xylariaceae tại KVNC
3.4. Nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài nấm và ho
ạt tính sinh
học của chúng
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: Các loài nấm túi họ Xylariaceae.
- Phạm vi nghiên cứu: RNS
Mường Phăng – Điện Biên và VQG Cúc
Formatted: Vietnamese

- Bổ sung 4 chi, 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam.
Trong 49 taxon được phân tích trình tự ADN có 5 taxon có trình tự lần đầu
tiên công bố cho khoa học.
- Xây dựng 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài, mô tả
chi tiết 114 taxon ở khu vực nghiên cứu, có ảnh, mẫu lưu kèm theo.
-
Xây dựng mối quan hệ di truyền cho 49 taxon thuộc 8 chi của nấm túi
họ Xylariaceae ở Việt Nam.
Formatted: Vietnamese
Formatted: Czech
Deleted: Lần đầu tiên x

4
- Tách chiết và xác định được 13 hợp chất từ 4 taxon nấm túi họ Xylariaceae
là: B. Philippinensis MP136
, D. concentrica CP002, X. atrosphaerica CP257,
X. Schweinitzii CP613, trong đó có 1 hợp chất mới cho khoa học và 12 hợp
chất lần đầu tiên được tìm thấy trong các loài thuộc họ Xylariaceae thu được
ở Việt Nam.
- Bước đầu thử hoạt tính sinh học của 3 hợp chất tách chiết từ loài D.
concentrica CP002
có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ưng thư ở người (ung
thư biểu bì, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan).


Clavariaceae ra thành một họ mới, ban đầu lấy tên là “Xylariei”. Những kết
quả nghiên cứu sau này về cả đặc điểm hình thái lẫn cấu trúc hiển vi đã xác
định Xylariaceae là họ độc lập và có số lượng loài rất đa dạng [158].
Mặ
c dù hệ thống phân loại nấm túi đã dần được hoàn thiện, tuy nhiên
vẫn còn rất nhiều tranh cãi và bàn luận, các nhà khoa học dựa trên các quan
điểm khác nhau đã đưa ra những nhận định cũng như hệ thống phân loại khác
nhau. Lumbsch và Huhndorf (2010) khi kết hợp các kết quả nghiên cứu về
sinh học phân tử và phân loại hình thái đã đưa ra hệ thống phân loại trong
ngành nấm túi bao gồm ba phân ngành, được các nhà khoa học hiện nay sử
dụng rộ
ng rãi nhất [77]. Vận dụng cách phân loại này, kết hợp với các công
bố trên Catalogue of life năm 2013, chúng tôi xác định vị trí họ Xylariaceae
thuộc bộ Xylariales, lớp Sordariomycetes, ngành nấm túi Ascomycota, kết
quả được thể hiện tại (Bảng 1.1) [77
, 182].
Deleted: 77
Deleted: 78
Deleted: 77
Deleted: 77
Deleted: 77
Deleted: 182
Deleted: 182
Deleted: 1

6
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của nấm họ Xylariaceae trong hệ thống phân loại nấm hiện nay [77, 78, 182]

Giới
Nấm

14. Lớp Sordariomycetes

1. Bộ Boliniales
2. Bộ Calosphaeriales
3. Bộ Chaetosphaeriales
4. Bộ Coniochaetales
5. Bộ Coronophorales
6. Bộ Diaporthales
7. Bộ Hypocreales
8. Bộ Lulworthiales
9. Bộ Melanosporales
10. Bộ Microascales
11. Bộ Ophiostomatales
12. Bộ Phyllachorales
13. Bộ Sordariales
14. Bộ Trichosphaeriales
15. Bộ Xylariales

1. Họ
Amphisphaeriaceae
2. Họ Cainiaceae
3. Họ Clypeosphaeriaceae
4. Họ Diatrypaceae
5. Họ Graphostromataceae
6. Họ Hyponectriaceae
7. Họ Iodosphaeriaceae
8. Họ Myelospermataceae
9. Họ Xylariaceae
Annulohypoxylon, Kretzschmaria (Hình 1.1. F); dạng cầu (spherical) có cuống
hoặc không cuống ở các chi Daldinia, Rosellinia hay Xylaria. Ngoài ra, các chi
Xylaria, Kretzschmaria có chất nền hình chùy (clavate) hoặc hình trụ
(cylindrical) (Hình 1.1 I, J, L).
Chất nề
n của nấm túi họ Xylariaceae thường có màu đen, tuy nhiên
cũng có rất nhiều loài trong một chi có màu sắc khác nhau như màu vàng,
màu nâu, màu trắng.
Kích thước chất nền của các loài trong họ Xylariaceae khác nhau
nhiều, từ một vài milimét (mm) cho tới hàng chục xentimét (cm) (Xylaria
allantoidea có chiều dài chất nền tới 15 cm, trong khi đó chất nền của X.
heliscus chỉ đạt 3 mm).

8

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái chất nền đặc trưng của họ Xylariaceae [147]
A. Daldinia eschscholzii, B. Biscogniauxia capnodes, C. Hypoxylon
monticulosum, D. Rhopalostroma lekae, E. Kretzschmaria clavus, F.
Annulohypoxylon bovei var.microspora. G. Rosellinia procera. H. Astrocystis
mirabilis, I. Xylaria sp, J. X. cubensis, K. X. magnoliae var. microspora, L. X.
allantoidea. Kích thước: A–B, I–L = 1 cm; C, F–H = 5 mm; D–E = 2 mm.

1.1.2.2. Thể quả (Perithecia)
Thể quả là cơ quan sinh sản hữu tính của nấm túi. Ở giai đoạn trưởng thành
thể quả thường có màu đen, bên trong chứa rất nhiều túi bào tử. Thể quả thường
có hình cầu, hình trứng, hình elip, hình trụ và một số ít là có hình nón, trong đó

9
hình cầu và hình trứng gặp phổ biến trong chi Hypoxylon, Annulohypoxylon. Các
loài có thể quả hình trụ thường gặp ở chi Daldinia, Biscogniauxia. Hình nón có ở

1.1.2.4. Túi bào tử (Asci)
Túi bào tử là cơ quan sinh sản, đảm nhiệm chức năng lưu giữ và bảo
vệ các bào tử. Túi bào tử có thể hình chùy và phổ biến nhất là hình trụ
(Hình 1.4). Trong mỗi túi luôn có 8 bào tử. Túi bào tử ở Xylariaceae có
một lớp vỏ, trong suốt, thường có cuống nhỏ, vỏ mỏng. Một số ít có dạng
hình thoi, gặp ở một số loài trong chi Rosellinia.
Túi bào tử cũng là chỉ tiêu quan trọng trong định loại nấm túi
đặc biệt
là phân biệt giữa chi Xylariaceae với các họ khác.
Deleted: 55
Deleted: 55
Deleted: 55

11

Hình 1.4: Đặc điểm hình thái túi bào tử đặc trưng của họ Xylariaceae [147]
A. Hypoxylon fuscum. B. Camillea selangorensis. C. Kretzschmaria clavus. Tỉ lệ:
A–B = 10 μm; C = 25 μm.

Đỉnh túi bào tử (apical apparatus) là chỉ tiêu quan trọng trong nghiên
cứu định loại. Hầu hết đỉnh túi bào tử của các loài có phản ứng màu xanh
nhưng cũng có một số loài đỉnh túi bào tử không bắt màu với thuốc nhuộm
Melzer's. Các nhà phân loại nấm túi họ Xylariaceae thường dựa vào hình
dạng và kích thước của đỉnh túi bào tử để phân biệt các chi trong họ. Đỉnh
túi bào tử thường có dạng hình đĩa hoặc hình trụ, một số ít có hình nón,
hình nụ hoa [147].
Đỉ
nh túi bào tử hình đĩa thường gặp ở chi Hypoxylon, Annulohypoxylon
và một số loài của chi Biscogniauxia; hình trụ gặp nhiều ở chi Xylaria,
Rosellinia, Kretzschmaria và Nemania; hình nón được tìm thấy ở một số loài