BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

KIỀU THỊ LAN

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH
DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : Hóa học phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

Hà Nội – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
----------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH TINH
DẦU TỪ HẠT GẤC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV VÀ
SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

Sinh viên thực hiện: Kiều Thị Lan


Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới
sự hướng dẫn khoa học của ThS. Vũ Thị Kim Thoa.Các kết quả và số liệu trong
khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Kiều Thị Lan

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN


Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.4.5.6. Đầu dò. ................................................................................................................. 19
1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu. ........................................................................................... 20
1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu. ............................................................................................... 20
1.4.6. Các bước tiến hành sắc kí. ............................................................................. 20
1.4.6.1. Chuẩn bị dụng cụ, máy móc. ............................................................................. 20
1.4.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động. ........................................................................... 20
1.4.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC. .................................................................................... 21
1.4.6.4. Cách vận hành thiết bị. ....................................................................................... 21
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 22
2.1. Đánh giá qui trình chiết từ hạt gấc .......................................................................... 22
2.1.1. Phổ hấp thụ các chất chứa gốc với 3 nối liên hợp ............................................ 22
2.1.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang A của dầu hạt gấc với nồng độ của dầu gấc
(mg/ml). ............................................................................................................................... 22
2.1.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào các dung môi ........................................... 23
2.1.4. Chiết tinh dầu hạt gấc bằng các dung môi hữu cơ............................................ 24
2.2.

ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH LÀM SẠCH TINH DẦU GẤC ............................... 30

2.2.1. Nghiên cứu quá trình làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn .................. 31



Wavelength

Bước sóng

UV-VIS

Ultraviolet-Visible

Phổ tử ngoại khả kiến

High Performance Liquid

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu

Chromatography

năng cao

HPLC

Reverse Phase
RP-HPLC

High Performance Liquid
Chromatography
Normal Phase

NP-HPLC

Bảng 2.6. Kết quả khảo sát quá trình hấp thụ dầu hạt gấc trên cột DIAPAK C. ......32
Bảng 2.7. Phần trăm giải hấp chất phân tích bằng các hệ dung môi khác nhau .......34
Bảng 2.8. Kết quả rửa giải dầu bằng phương pháp chiết pha rắn .............................34
Bảng 2.9. Các thông số trong sắc kí đồ khi phân tích dầu hạt gấc bằng RP-HPLC .41
Bảng 2.10. Kết quả xác định thành phần của các triglixerit chính trong dầu hạt gấc ......46
Bảng 2.11. Kết quả xác định hàm lượng dầu và thành phần của các axit béo có trong
dầu hạt gấc. ................................................................................................47

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1.a.b: Gấc nếp ..................................................................................................3
Hình 1.2. Hoa và quả gấc ............................................................................................4
Hình 1.3. Màng gấc .....................................................................................................4
Hình 1.4. Hạt gấc ........................................................................................................4
Hình 1.5. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải ....................................13
Hình 1.6. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B ...............................13
Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B..................................................................14
Hình 1.8. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B 15
Hình 1.9. Cách tính hệ số khôngđối xứng của peak .................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ bước chuyển năng lượng của dao động electron (A) và phổ hấp thụ
phân tử của hợp chất chứa ba nối đôi liên hợp (B). .................................22
Hình 2.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dầu hạt gấc (trong dm nhexan) ......................................................................................................23

bằng aceton A- dầu hạt gấc trước khi được làm sạch, 1-4: các phân đoạn
dầu thu được sau 1-4 ml rửa giải .............................................................37
Hình 2.16. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel ..............38
Hình 2.17. Quá trình giữ của αE2S trong trạng thái hấp phụ trên silicagel theo thời
gian. .........................................................................................................39
Hình 2.18. Sắc ký đồ của dầu hạt gấc (A) trên nền dầu chuẩn momordica charantia
(B) ............................................................................................................41
Hình 2.19. Ba dạng cấu hình của các acid liên hợp octadecatrienoic có trong thiên
nhiên và dạng phổ hấp thụ phân tử của chúng ........................................43
Hình 2.20. Phổ hấp thụ electron trong dung môi 40% isopropanol và 60%
acetonitrin được đo trong cuvet của đầu dò diot quang (DAD). .............44
Hình 2.21. Các mẫu gấc được thu hái từ các tỉnh khác nhau. ...................................45
Hình 2.22. Kết quả tách triglixerit có trong dầu hạt gấc. ..........................................46

Kiều Thị Lan

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển khoa học, nhiều loại bệnh đã được phát hiện
và bước đầu nghiên cứu về phương pháp điều trị.Để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức
khoẻ người bệnh, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chế tạo nhiều loại thuốc đặc
trị. Tuy nhiên, sau một thời gian sử dụng thì một số loại thuốc gây ra các tác dụng
phụ làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người bệnh chính vì vậy các nhà khoa học
quay trở lại với thiên nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học, dược tính của các chất


Khóa luận tốt nghiệp

chống ung thư, chống giảm béo (CLA). Ngoài ra trong hạt gấc còn có một số các
hợp chất giá trị khác như saponin, ankaloit,…Tuy nhiên hiện nay ứng dụng của gấc
ở nước ta mới chỉ dùng lại ở việc sử dụng cơm gấc và màng đỏ bao quanh hạt gấc là
chủ yếu.Việc nghiên cứu để chiết xuất các hợp chất có giá trị trong hạt gấc hầu như
chưa được đề cập và chưa đưa vào sản xuất.Chính vì vậy, việc nghiên cứu để chiết
và làm sạch tinh dầu từ hạt gấc là nhu cầu cấp bách để tiến tới có thể tạo ra những
sản phẩm thương mại có giá trị từ hạt gấc.
Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Đánh giá quy trình chiết và làm sạch tinh dầu
từ hạt gấc bằng phương pháp phổ UV và sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC ” với mục

tiêu nghiên cứu như sau:
- Tìm ra quy trình chiết thành phần glixerit từ hạt gấc.
- Tìm ra quy trình tinh chế và làm sạch dầu gấc chiết được.
- Sử dụng phương pháp trắc quang UV-VIS và phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao để đánh giá hiệu quả chiết và làm sạch tinh dầu gấc đồng thời phân tích
thành phần glixerit của nó.

Kiều Thị Lan

2

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hoa nở vào tháng 4 đến tháng 5, hoa đực và hoa cái riêng trên cùng một
cây; hoa đực mọc ở kẽ lá; tràng 5 cánh, màu trắng hoặc ngà vàng, hình trứng
thuôn, có lông dày ở mặt trong; hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì.
Quả to hình bầu dục dài từ 15 - 20cm, đuôi nhọn có nhiều gai mềm đỏ
đẹp. Quả non màu xanh, quả chín màu đỏ tươi. Bổ đôi theo chiều ngang thấy
có 6 hàng hạt xếp đều nhau, mỗi hàng có từ 6 đến 10 hạt. Quanh hạt có nhiều
màng màu đỏ tươi. Người ta còn dựa vào độ sai của quả (nhiều hay ít), kích
thước của quả (to hay nhỏ), gai quả (dày hay thưa), màu sắc của ruột quả (đỏ
hay vàng gạch), dầu (ít hay nhiều), số lượng hạt (nhiều hay ít) để phân loại:
gấc tẻ, gấc nếp hay gấc lai.
Hạt gấc có màng đỏ bao quanh lớp vỏ cứng đen, quanh mép có răng
cưa tù và rộng, hạt dày 25 - 35mm, rộng 19 - 31mm trông gần giống con ba
ba nhỏ bằng gỗ trong hạt có nhân chứa dầu.

Hình 1.2: Hoa và quả gấc

Hình 1.3: Màng gấc

Hình 1.4: Hạt gấc
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
Chi Momordica L. có khoảng 45 loài trên thế giới, đa số là cây trồng, tập
trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ. Châu Á có 5-7 loài, trong đó
Việt Nam có 4 loài (M. Karaudren Aymonin, 1975 và Nguyễn Hữu Hiếu, 1994).


2

Protein

2,1

3

Lipide

7,9

4

Glucide

10,5

5

Xơ

1,8

6

Muối khoáng

0,7

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cô đặc dung dịch chiết và trơ về mặt hóa học (không phản ứng với những chất
nghiên cứu, không độc, không dễ bốc cháy). Những dung môi này cần phải
được làm sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn những chất khác thì ảnh
hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết.
Methanol (CH 3 OH) và Chlorofom (CCl 3 ) thường chứa chất diotyl phtalat
[di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat].Chất này sẽ làm sai lệch
kết quả phân tích trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, ngoài ra nó có thể
làm bẩn dung dịch chiết của mẫu vật.
Methanol (CH 3 OH) và Ethanol 80% (C 2 H5OH) là những dung môi phân
cực hơn các hidrocacbon thế đó, các dung môi thuốc nhóm rượu sẽ thấm tốt
hơn vào màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Dung môi cồn trong nước có những đặc
tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Người ta cũng thường ít sử dụng nước để thu
được dung dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của
methanol.
Ví dụ về lựa chọn dung môi trong chiết xuất được thể hiện ở bảng sau:

Kiều Thị Lan

6

K40C – Sư phạm Hóa học


Ethylacetat

Alcanoid, Aglycogen, Glycosid

Aceton

Flavonoid, Alcanoid, Aglycogen
Tannin, Polyphenol, Terpenoid,

Ethanol

Flavonoid, Serol, Alcanoid,
Polyacethylen

Trung bình

Saponin, Tanin, Phenol, Flavon,
Đường, Aminoacid,
Methanol

Anthrocyanidin, Terpenoid,
Xanthoxyllin, Totarol, Lactone,
Polyphenol
Đường, Aminoacid, Saponin,

Nước

Tanin, Lectin, Terpenoid,
Anthrocyanin, Tinh bột, Polypeptid


+ Khuếch tán các chất từ mặt ngoài dược liệu ra lớp dung môi xa hơn
(khuếch tán phân tử).
+ Khuếch tán các chất theo dòng chuyển động của dung môi (khuếch
tán đối lưu).
1.2.3. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết xuất là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của
quá trình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm các phương pháp
truyền thống và phương pháp hiện đại.
Phương pháp truyền thống sử dụng dung môi kết hợp với gia nhiệt và khuấy
trộn. Các phương pháp chiết xuất hay sử dụng như:
a) Phương pháp chiết lạnh.
− Phương pháp ngâm.
− Phương pháp ngấm kiệt.
b) Phương pháp chiết nóng
− Phương pháp sắc.
− Phương pháp hãm.
− Phương pháp hầm.
− Phương pháp lôi cuốn hơi nước.
− Phương pháp chiết Soxhlet.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi lẽ phương pháp này không đòi hỏi nhiều thời gian,

Kiều Thị Lan

8

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

− Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng – MAE).
− Chiết xuất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn – SPE).
− Chiết xuất bằng dung môi dưới áp lực cao (Chiết dung môi nhanh – ASE).

Kiều Thị Lan

9

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN
1.3.1. Định nghĩa về chiết pha rắn.
Chiết pha rắn (SPE) (Solid – Phase Extraction) là quá trình phân bố chất tan
giữa hai pha lỏng – rắn có thể là các hạt silicagel xốp, các polime hữu cơ hoặc các
loại nhựa trao đổi ion hay than hoạt tính. Quá trình chiết có thể thực hiện ở điều
kiện tĩnh hay động. Các chất bị giữ lại trên pha rắn có thể được tách ra bằng cách
rửa giải với dung môi thích hợp. Thông thường thể tích cần thiết để rửa giải hoàn
toàn chất phân tích luôn nhỏ hơn rất nhiều so với thể tích của dung dịch mẫu ban
đầu, vì thế có hệ số làm giàu cao.
1.3.2. Các cơ chế chiết pha rắn.
Về cơ bản, cơ chế chiết SPE giống với cơ chế tách trong phương pháp sắc kí
lỏng hiệu nâng cao (HPLC) gồm 3 cơ chế chính: cơ chế hấp phụ pha thường, cơ chế
hấp phụ pha đảo và cơ chế trao đổi ion. Tuy nhiên, SPE khác với HPLC là trong
HPLC có sự tách chất phân tích ra khỏi nhau trong hệ dòng chảy liên tục của pha
động, còn SPE giữ chất phân tích lại trên pha rắn sau đó rửa giải chất phân tích ra

Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi
phân cực hay không phân cực với chất hấp thu trao đổi ion. Cơ chế tương tác ion
này có nang lượng cao (80Kcal/mol). Vì vậy, các chất tan phân cực có thể hấp thu
hiệu quả từ dung môi phân cực cũng như tù dung môi không phân cực. Trong quá
trình hấp thu sẽ xuất hiện sự cạnh tranh để trao đổi ion. Quá trình này phụ thuộc vào
độ chọn lọc của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí này. Do vậy, chất chất
tích được làm giàu sẽ phải cạnh tranh với các ion khác trong dung dịch mẫu. Sự trao
đổi ion là quá trình thuận nghịch.
Các chất hấp thụ trao đổi thường có chứa các nhóm chức anion hoặc các
cation liên kết với silica.Các chất trao đổi cation mạnh có chứa nhóm chức axit
sulfonic và các chất trao đổi ion yếu thường là các nhóm axit cacboxylic. Đối với
các chất trao đổi anion mạnh là các nhóm chức chứa amin bậc 4, còn các chất trao
đổi anion yếu thường là bậc 1,2 và 3.
Pha tĩnh thường là silica liên kết với nhóm chức anion hay cation. Nếu là các
chất trao đổi cation mạnh thì dùng silica liên tiếp với nhóm sulfonic axit, còn là chất
trao đổi yếu thường là liên kết với nhóm – COOH.
Việc rửa giải các chất phân tích hấp thu trên pha tĩnh có thể tiến hành theo
nhiều cách: nếu là trao đổi cation có thể dùng H+ của axit mạnh hoặc dùng các
cation mạnh hơn, nếu là trao đổi anion thì dùng OH − hoặc các anion khác.
1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc
kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là
phương pháp sắc kí lỏng cao áp ( High Pressure Liquid Chromatography). Phương
pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp

Kiều Thị Lan

11

K40C – Sư phạm Hóa học

nhau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng hợp các
tương tác.

Kiều Thị Lan

12

K40C – Sư phạm Hóa học


Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chất phân tích A+B+C
F1
Pha tĩnh

F3
F2

Pha động

Hình 1.5.Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột
nước trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi
chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1,F2,F3. Trong đó, F1 và F2 giữ vai trò
quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây, F1 là lực giữ chất phân
tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy,
với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ di

t0: thời gian lưu chết.
trA: thời gian lưu chất A.

trB: thời gian lưu chất B.

t’rB: thời gian lưu thực chất A.

t’rB: thời gian lưu thực chất B.

Hình 1.7. Sắc kí đồ của chất A và chất B
a) Thời gian lưu thực.
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và
các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc kí đã
chọn.Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
− Bản chất sắc kí của pha tĩnh.
− Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
− Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
− Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
b) Hệ số dung lượng K’.
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

Kiều Thị Lan

14

K40C – Sư phạm Hóa học

chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân
tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung
bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
− Đường kính và độ hấp phụ của pha tĩnh.
− Tốc độ và độ phân cực của pha động.
− Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với mỗi điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lí thuyết của cột cũng được xác định.

Kiều Thị Lan

15

K40C – Sư phạm Hóa học