Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
Khoa Chăn Nuôi – Thú Y
Môn: Dược Phân Tích
Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá
trinh nữ hoàng cung bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và điện
năng di mao quản
Sv thực hiện:
Ngô Thị Uyên Phương
Trần Thị Thu Thảo
Nguyễn Thị Cẩm Tiên
Triệu Thu Nghiêm
Huỳnh Phú Quý
Huỳnh Thị Kim Thu
GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.

Trinh nữ hoàng cung hay Náng lá rộng, Tỏi
lơi lá rộng, Tây nam văn châu lan, Tỏi Thái
Lan, tên hán văn là Vạn châu lan hay Thập
bát học sỹ

Danh pháp khoa học:Crinum latifolium- là một
loài thực vật có hoa trong họ Amaryllidaceae.

Được miêu tả khoa học đầu tiên năm 1753.

Cây Trinh nữ hoàng cung có nguồn gốc từ Ấn
Độ

Các nước vùng Đông Nam Á như Thái Lan,
Lào, Malaysia, Việt Nam và phía Nam Trung

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu:
Astragalin, isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ
lá TNHC. Lá TNHC được thu hái tại huyện Tây Sơn
tỉnh Bình Định vào tháng 4 năm 2012 và định danh
bởi PGS. Võ Thị Bạch Huệ - khoa Dược, Đại học Y
Dược TP Hồ Chí Minh.
Trang thiết bị

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2695-2996

Máy điện di mao quản Agilent G7100A
Dung môi, hóa chất

Acenitril, methanol dùng cho HPLC

Acid hydrocloric, ethyl acetat

Natri hydroxyd, acid phosphoric,acid boric,
dinatri tetraborat
Phương pháp nghiên cứu

Cân chính xác 10g bột lá TNHC ( độ ẩm 12%)
cho vào cốc có mỏ 250 ml.

Ở 50 0C siêu âm 3 lần, mỗi lần 30 phút với
50ml cồn 70%.

Chiết xuất cao Flavonoid từ lá TNHC:


boric, thêm nước để được 50 ml.
Dung dịch đối chiếu
Pha dung dịch đối chiếu trong methanol
Nồng độ của : astragalin 250 (µg/ml)
isoquercitrin 100 (µg/ml)
Thêm vào dung dịch đối chiếu một lượng
chuẩn nội quercetin đạt nồng độ 100 (µg/ml)

Dung dịch thử

Toàn bộ cao Flavonoid được hòa tan và điền đầy bằng
methanol trong bình định mức 10 ml.

Lọc qua màng lọc 0,22 µm, siêu âm 10 phút trước khi
tiêm vào hệ thống CE.
Điều kiện điện di

Cột mao quản silica nung chảy :
Chiều dài tổng cộng: 64,5 cm
Chiều dài hiệu quả: 56 cm
Đường kính trong: 50 µm
Thể tích tiêm mẫu: 50 mbar’ x5 giây
Điện thế: 25 kV
Nhiệt độ cột: 25 0C

Dung dịch đệm dinatri tetraborat 45 mM có 10% methanol,
pH 9,0.

Bước sóng phát hiện cả hai phương pháp: 264 nm.
Khảo sát tính phù

RS TB - 12,8 5,01 11,84
RSD (%) - 0,6 1,00 0,84
AF TB 1,31 1,06 1,43 1,28
RSD (%) 1,05 1,28 1,02 1,33
Thẩm định quy trình
1. Tính đặc hiệu
Sắc ký mẫu trắng, mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu, mẫu thử thêm
hỗn hợp đối chiếu theo điều kiện sắc ký đã chọn.
Kết quả: sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE mẫu trắng không có
pic có thời gian lưu trùng với các pic của mẫu đối chiếu.
Sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE của mẫu thử của các pic có
thời gian lưu tương đương với các pic của mẫu đối chiếu.
Khi thêm vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu thì có sự tăng
lên về diện tích (hoặc tỷ số diện tích) trong mẫu thử. Phổ UV tại
thời gian lưu của các pic trong mẫu thử giống mẫu đối chiếu.






2. Tính tuyến tính
Pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 50 đến 1000
(µg/ml)
Độ chính xác:
Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ và
điều kiện.
Độ chính xác trung gian:
Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ
trong 6 ngày liên tiếp.

Hàm
lượng(ppm)
-định lượng
bằng CE
279,99 282,85
276,06 274,65
278,75 292,75
274,86 288,00
268,40 271,01
286,91 273,11
TB: 277,49 TB: 280,40
RSD: 2,21% RSD: 3,15%
Isoquercitrin
Hàm lượng(ppm)
-định lượng bằng
HPLC
Hàm
lượng(ppm)
-định lượng
bằng CE
125,8 130,95
124,7 132,06
130,0 129,45
124,7 131,86
125,9 124,30
130,1 127,48
TB: 126,87 TB: 129,35
RSD: 1,99% RSD: 2,32%
Bảng 5: Kết quả định lượng astragalin và isoquercitrin trong lá
TNHC bằng phương pháp HPLC và CE(n=6)

Điện di đồ: đệm Borat (45mM), pH
9, 10% methanol, 25oC, 25 kV.
Đầy đủ yêu cầu về:
─ Tính tuyến tính.
─ Khoảng xác định.
─ Độ chính xác.
─ Độ đúng.
BÀN LUẬN
Lựa chọn astragalin và isoquercitrin làm chất đối
chiếu là phù hợp vì chiếm hàm lượng cao trên sắc ký đồ
và điện di đồ của mẫu thử ( 264; 346 nm của astragalin
và 256; 353 nm của isoquercitrin).

HPLC: isoquercitrin được rửa giải trước với hệ sắc
ký pha đảo.

CE: astragalin được rửa giải trước (theo đúng cơ
chế hoạt động của phương pháp CE).
BÀN LUẬN