VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

Chuyên ngành:
Mã số:

Hóa sinh học

quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN.
Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... viii


1.2.4.

Rối loạn phát triển lan toả không xác định ...................................................... 12

1.2.5.

Phương pháp chẩn đoán và điều trị .................................................................. 12

1.3.

Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ........................................... 15

1.3.1.

Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ .......................................... 15

1.3.2.

Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học ............................................... 17

1.4.

Các tiến bộ nghiên cứu về di truyền của rối lo n phổ tự kỷ bằng giải
tr nh tự gen thế hệ mới .................................................................................. 23

1.4.1.

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới........................................................ 23


2.3.3.

Giải trình tự gen bằng máy Illumina ................................................................ 38

2.3.4.

Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu............................................................. 38

2.3.5.

Nhân gen bằng kĩ thuật PCR............................................................................ 43

2.3.6.

Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger....................................................... 43

2.3.7.

Phân tích các gen trong mối tương tác............................................................. 44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 46
3.1.

Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 46

3.2.

Giải tr nh tự toàn bộ vùng mã hóa ............................................................... 47

3.2.1.

3.3.5.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06................................................................. 65

3.3.6.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07................................................................. 73

3.3.7.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08................................................................. 79

3.3.8.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09................................................................. 83

3.4.

Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 86

3.5.

SNP RS7725785 trên gen HTR4.................................................................... 88

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ....................................................................... 89
4.1.

Xác định và chú giải biến thể ........................................................................ 89

4.2.

tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADI-R:

The Autism Diagnostic Interview - Bảng phỏng vấn chẩn đoán
tự kỷ có điều chỉnh
Revised

ADOS

The Autism Diagnostic Observation Bảng quan sát chẩn đoán tự
Schedule
kỷ

ASD

Autism Spectrum Disorders

Rối loạn phổ tự kỷ

BWA

Burrows - Wheeler Alignment Tool

Công cụ
gióng

CS
DBC-P

hàng

Cowden syndrome
Hội chứng Cowden
Developmental Behavior Checklist for Bảng câu hỏi phát triển hành
Parent
vi cho bố mẹ

dbSNP

The Single Nucleotide Polymorphism Ngân hàng dữ liệu đa hình
đơn nucleotide
Database

DSM

Diagnostic and Statistical Manual of Cẩm nang chẩn đoán và
thống kê về chứng rối loạn
Mental Disorder
tâm thần

FXS

Fragile X

Hội chứng X dễ gãy


International Classification of Diseases

Phân loại quốc tế về bệnh tật

IGV

Integrated Genomics Viewer

Công cụ xem hệ gen hợp
nhất

Intellectual disability

Khuyết tật trí tuệ

ID

M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers
MECP2
NCBI

Bảng sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ
chập chững biết đi có sửa đổi

Chromatin architecture genes
Các gen cấu trúc chromatin
National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công
Information
nghệ sinh học


SBL

sequencing by ligation

Giải trình tự bằng ghép nối

SBS

sequencing by synthesis

Giải trình tự bằng tổng hợp

TS

Tuberous Sclerosis

Bệnh xơ cứng não củ

WES

Whole exome sequencing

Giải trình tự toàn bộ hệ gen
mã hóa

WGS

Whole Genome Sequencing

Giải trình tự toàn bộ hệ gen


Kết quả gióng hàng của các mẫu giải trình tự với hệ gen
tham chiếu................................................................................

50

Bảng 3. 4.

Kết quả xác định và chú giải biến thể......................................

51

Bảng 3.5.

Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh nhân.............

52

Bảng 3.6.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T01...................................................................................

53

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T01............................................................................................

55


Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T06..................................................................................

67

Bảng 3.13.

Bảng thống kê biến thể của bệnh nhân T06.............................

68

Bảng 3.14.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T07...................................................................................

74

Bảng 3.15.

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T07............................................................................................

viii

76


Bảng 3.16.


Bảng 3.18.
Bảng 3.19.
Bảng 4.1.
Bảng 4.2.

ix

80


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nước phát triển trên thế giới..........

6

Hình 1.2.

Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nước trong khu vực Châu
Á.............................................................................................

8

Hình 1.3.

Tình hình bệnh tự kỷ ở Việt Nam...........................................

9


46

Hình 3.2.

Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA...........................

47

Hình 3.3.

Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng.......................

48

Hình 3.4.

Chất lượng dữ liệu của FastQ của các mẫu.............................

49

Hình 3.5.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01.............................

54

Hình 3.6.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02............................


biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T03...........................................................................................

65

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06............................

67

Hình 3.8.

Hình 3.11.

x


Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T06..........................................................................................

69

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T06..........................................................................................

69

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho phát
hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3

biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

76

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

77

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

77

Mô hình mô phỏng cấu trúc đột biến p.Arg801Cys và
p.Tyr819Cys ở bệnh nhân T07...............................................

78

Hình 3.23

Trình tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau.............

79

Hình 3.24.


Hình 3.26.

xi


Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T09...........................................................................................

85

Hình 3.28.

Các họ kênh ion và các gen liên quan.....................................

87

Hình 3.29.

Đa hình c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08,
T09...........................................................................................

88

Vai trò của gen HTR4..............................................................

107

Hình 3.27.


phương pháp nghiên cứu đã và đang đạt được nhiều bước tiến nhảy vọt trong
nghiên cứu di truyền bệnh này. Giải trình tự vùng mã hóa - Whole exome
sequencing (WES) là một ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác
định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen. Hàng chục nghìn biến
thể gen có thể được xác định trên exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch,


2

thần kinh,... WES đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm
gần đây. Do đó, WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền
bệnh tự kỷ.
Tại Việt Nam, bệnh tự kỷ cũng có xu hướng tăng nhanh và cũng chưa có
phương pháp chữa trị triệt để, mà chỉ có các phương pháp hỗ trợ, cải thiện tình hình
bệnh. Đặc biệt, tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền bệnh còn rất hạn chế. Xuất
phát từ những thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số
bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải tr nh tự toàn bộ vùng mã
hóa (exome)” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng tỏ nguyên nhân
gây bệnh tự kỷ ở người Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu
di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng có thêm hướng
điều trị bệnh hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.
Mục tiêu của đề tài
1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân
tự kỷ Việt Nam.
2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một
số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:
1. Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.
2. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình.
3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam.

hành vi. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất
về mặt di truyền.
Bệnh nhân tự kỷ biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã
hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động
mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Hiện tượng này bao gồm nhiều biểu hiện khác
nhau, ví dụ như người bệnh hay có hành động quay cổ tay, quay đầu hay có những
hành động có tính bắt buộc như xếp đồ chơi, búp bê, ô tô thành một hàng ngang
hoặc dọc. Nguy hiểm nhất chính là bệnh nhân hay tự làm mình bị thương như: lấy
tay chọc lên mắt, cấu lên da, tự đánh vào tay và đầu. Một dấu hiệu nữa là trẻ mắc
bệnh thường có khả năng đi lại chậm hơn nhiều so với trẻ khác, phải mất 2-3 năm
tuổi mới đi lại bình thường được. Khả năng giao tiếp bằng mắt của trẻ không tốt và
bệnh nhân thường có thái độ hờ hững với mọi thứ xung quanh.
Ngoài những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, khoảng 31% bệnh nhân bị
khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật (Canitano, 2007; Liu and Takumi ,
2014; Srivastava and Schwartz, 2014). Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD
bao gồm rối loạn lo âu (White et al, 2009), rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa
(Valicenti-McDermott et al, 2006) và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm
giác (Rogers et al, 2003). Các triệu chứng chính của ASD thường xuất hiện sớm,
khoảng 6 tháng tuổi và thể hiện rõ khoảng năm 2-3 tuổi. Bệnh gặp phổ biến ở bé
trai nhiều hơn bé gái, với tỷ lệ khoảng 4:1 (Baio et al, 2018). Bệnh tự kỷ là bệnh có
cơ sở di truyền rất phức tạp do sự tương tác của nhiều gen. Sự tương tác của gen với


5

môi trường hay những yếu tố ngoại cảnh khác không làm biến đổi DNA nhưng ảnh
hưởng đến biểu hiện gen. Cơ sở di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến
sự ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau (Inoue et al, 2015). Trong những
nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD ở những cặp
song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác


Tỷ lệ bệnh năm 2015 theo thống kê của Baxter và cộng sự đã có sự gia tăng
đáng kể, ước tính khoảng 7,6/1000, tức là trong 132 người thí có 1 người mắc ASD
(Baxter et al, 2015). Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC) ở Mỹ đã
đưa ra tỷ lệ trẻ mắc những rối loạn thần kinh trên toàn cầu năm 2014 là 1% (CDC,
2014). Hiện nay, có hơn 3,5 triệu người Mỹ mắc bệnh tự kỷ, ước tính 1/68 trẻ em
được chẩn đoán mắc bệnh (CDC, 2014). Như vậy, tỷ lệ tự kỷ ở trẻ em ở Hoa Kỳ
tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150) đến năm 2010 (1/68) (CDC, 2014) (Hình
1.1). Vì thế, tự kỷ được đánh giá là chứng khuyết tật có tỷ lệ phát triển nhanh nhất
(CDC, 2008). Điều này dễ dàng được giải thích bởi lối sống ngày càng thực dụng
tại Mỹ. Bên cạnh Mỹ, Anh cũng là một nước có tỷ lệ tự kỷ ở mức cao (xấp xỉ 1%)
(Brugha et al, 2011). Ngoài Anh và Mỹ có tỷ lệ mắc tự kỷ cao, bệnh cũng có mặt ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Do tỷ lệ trẻ tự kỷ gia tăng nhanh chóng đang đặt ra
những vấn đề lớn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Mỹ, tự kỷ được xếp vào
danh mục 13 dạng khuyết tật bẩm sinh và vấn đề trẻ tự kỷ đã được khẳng định là
một trong những ưu tiên hàng đầu trong chính sách y tế của nước này.
Tại một số nước ở châu Á hiện nay như Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Trung
Quốc, vấn đề tự kỷ cũng đã được các nhà khoa học và xã hội đặc biệt quan tâm.


7

Trước năm 1980, bệnh tự kỷ không được công nhận tại Trung Quốc, ước tính tỷ lệ
tự kỷ là 11,8 / 10.000 người, trong khi tỷ lệ hiện mắc của bệnh tự kỷ là 26,6 /
10.000 người. Ở Nhật Bản, gần đây ước tính tỷ lệ tự kỷ là 13/10.000 người. Điều
này cho thấy chứng tự kỷ là phổ biến ở châu Á hơn nhiều so với những thống kê
trên thế giới trước đây (Sun and Allison, 2010; Sun et al, 2013). Thang đo hành vi
tự kỷ Clancy (CABS), Danh mục kiểm tra hành vi tự kỷ (ABC) và Danh sách Kiểm
tra cho Tự kỷ ở trẻ vị thành niên (CHAT) thường được sử dụng làm công cụ chẩn
đoán ở Trung Quốc (Sun et al, 2013). Tại châu Á, 2 tác giả Sun và Allison đã tiến

còn chưa đầy đủ.
Tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2000 chỉ có 2 trẻ đến Bệnh viện Nhi đồng 1
khám và điều trị chứng tự kỷ, thì năm 2008 số trẻ đến khám là 324, tăng hơn 160
lần. Song những năm gần đây, số lượt trẻ đến khám tại Khoa Tâm thần (Bệnh viện
Nhi Trung ương) được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ hay có dấu hiệu tự kỷ ngày
càng gia tăng (Đậu Tuấn Nam and Vũ Hải Vân, 2015).

Hình 1.2 Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nước trong khu vực Châu Á
(Nguồn: http://global-disease-burden.healthgrove.com/)

Theo báo cáo của bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ đến khám muộn và được
chẩn đoán mắc bệnh tự kỷ vẫn còn tỷ lệ rất cao (43,86% trên 36 tháng tuổi). Số liệu
thống kê của Khoa Tâm bệnh (Bệnh viện Nhi Trung ương) cũng cho thấy, có sự
chênh lệch đáng kể giữa tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai và bé gái (bé trai nhiều hơn 4-6 lần


9

so với bé gái), ở thành thị mắc bệnh nhiều hơn ở nông thôn. Thông tin này phần nào
cho thấy, vấn đề nhận thức của người dân về bệnh rất quan trọng trong việc phát
hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.
Theo thống kê của Bệnh viện Nhi trung ương ghi nhận năm 2007 có khoảng
405 trường hợp thì đến năm 2015 đã ghi nhận có khoảng 200.000 trường hợp (Hình
1.3). Điều này cho thấy, tình hình trẻ mắc bệnh tự kỷ ngày càng tăng gây gánh nặng
và thách thức không nhỏ cho gia đình và xã hội. Đặc biệt, khi những người tự kỷ
trưởng thành sẽ làm thế nào để hoà nhập xã hội và làm cách nào để hạn chế mức độ
gia tăng cũng như có phương án điều trị cho những người đã mắc bệnh.

Hình 1.3 T nh h nh bệnh tự kỷ ở Việt Nam
(Nguồn: Bệnh viện Nhi trung ương, 2015)

1.2.1. Hội chứng Asperger
Hội chứng Asperger được đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa người Áo Hans
Asperger vào năm 1944 khi ông mô tả nhóm trẻ em trong nghiên cứu của mình với
những biểu hiện: thiếu giao tiếp, kém hiểu biết về những cảm xúc của người khác
và thể chất yếu. Ngày nay, hội chứng Asperger được đặc trưng bởi sự tách biệt về
mặt xã hội và các hành vi kỳ cục khi trẻ khi còn nhỏ. Có những khiếm khuyết trong
tương tác xã hội và giao tiếp không lời. Thể hiện một số hành vi đơn điệu, định
hình, lặp lại; Khó khăn trong tiếp thu và lĩnh hội hành vi phi ngôn ngữ như vẻ mặt,
tư thế, tiếp xúc mắt, điệu bộ; Yếu kém trong việc hiểu và thể hiện cảm xúc
(Hamilton, 2000). Mặc dù tuân theo các qui tắc ngữ pháp, nhưng cách nói của trẻ
nghe có vẻ lập dị do sự bất thường ở âm điệu và các khuôn mẫu lặp đi lặp lại. Sự


11

vụng về có thể dễ nhận thấy ở cách phát âm rõ ràng và các hành vi vận động thô.
Mặc dù các dấu hiệu bất thường xuất hiện sớm từ trước năm 2 tuổi, nhưng lại kéo
dài đến hết cuộc đời (Baskin et al, 2006; McPartland, 2006). Trẻ bị Asperger
thường có trí nhớ rất tốt, có trí tuệ trung bình hoặc trên trung bình. Trẻ có khả năng,
sở thích về kĩ thuật và toán học. Hội chứng Asperger khác tự kỷ là không chậm
hoặc trì trệ trong phát triển trí tuệ, ngôn ngữ và nhận thức. Ước tính hiện năm 2015
số lượng bệnh nhân mắc Asperger lên đến 37,2 triệu người trên toàn cầu
(Collaborators, 2016) và con số này vẫn đang ngày càng tăng lên.
1.2.2. Hội chứng Rett
Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1966 bởi một bác sĩ nhi ở
Vienna, Andreas Rett. Tuy nhiên, các bài viết của bác sĩ này bằng tiếng Đức nên
bệnh không được công nhận rộng rãi (Percy, 2014). Đến năm năm 1983, Bengt
Hagberg- một bác sĩ nhi khoa người Thụy Điển xuất bản một bài báo tiếng Anh mô
tả bệnh này và đặt tên bệnh là Rett. Đột biến gây ra bệnh này được công bố lần đầu
tiên vào năm 1999 bởi bác sĩ người Mỹ Li-băng, Huda Zoghbi (Amir et al, 1999).