ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,
MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)
THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC,
MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY ĐẬU NHO NHE (Vigna umbellata)
THU TẠI TỈNH YÊN BÁI VÀ LAI CHÂU

Ngành: Di truyền học
Mã ngành: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Quân

THÁI NGUYÊN - 2018

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Tác giả luận văn

Nguyễn Hải Yến

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe .................................................................................. 3
1.1.1. Hệ thống phân loại .............................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe .................................................................. 3
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của đậu Nho nhe .......................................................... 3
1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe ........................................................................ 6
1.2. Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật ............................... 7
1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu .......................................................... 10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ................................................................................ 14
2.1.1. Vật liệu .............................................................................................................. 14

TÀI LIỆU TIẾNG ANH ............................................................................................. 37

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
AFLP
bp

Tên tiếng Anh
Amplified Fragments Length
Polymorphism

Complementary DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

ITS
matK
mRNA
NADP
PCR
RAPD

RFLP

Đa hình độ dài các đoạn khếch đại


Nicotinamide

adenine Coenzym được sử dụng trong phản

dinucleotide phosphate

ứng đồng hóa

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

Random Amplification

Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên

of Polymorphic DNA
Restriction Fragment Length
Polymorphism

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

RNA

Ribonucleic acid

Ribonucleic Axit

rRNA



DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ glucosamine theo phương pháp Miller.................. 17
Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine .................................................................. 19
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái thân, lá (A), hoa (B), quả (C) và hạt (D) của mẫu
đậu Nho nhe ............................................................................................. 23
Hình 3.2. Giải phẫu lá của đậu Nho nhe .................................................................... 25
Hình 3.3. Giải phẫu thân của đậu Nho nhe ................................................................ 26
Hình 3.4. Giải phẫu rễ của đậu Nho nhe .................................................................... 26
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm
3 ngày tuổi ............................................................................................... 29
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số .......................... 30
Hình 3.7. Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB (A) và NN10-LC (B)......... 31
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu
đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự
vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI ................................. 32
Hình 3.9. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC
(A) và NN01-YB (B) với trình tự vùng gen ITS mang mã số
KX087818 trên GenBank ........................................................................ 33
Hình 3.10. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu
đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên
GenBank .................................................................................................. 35

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm
thực vật học, mã vạch DNA của cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata) thu tại tỉnh
Yên Bái và Lai Châu”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích và so sánh được đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và trình tự
vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Xác định và so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu cây đậu Nho nhe
thuộc tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
(2) Xác định đặc điểm hóa sinh liên quan tới hàm lượng protein tan, hoạt tính
α-amilase, protease và hàm lượng isoflavone của mẫu cây đậu Nho nhe thuộc tỉnh
Yên Bái và Lai Châu.
(3) Phân lập và xác định được trình tự vùng gen ITS từ mẫu cây đậu Nho nhe
thu được.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây đậu Nho nhe
1.1.1. Hệ thống phân loại
Đậu Nho nhe còn có tên gọi khác là đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng, đậu đà,
thua dài. Đậu Nho nhe là loại cây phát triển ở vùng nhiệt đới đặc biệt là Châu Á và
được trồng chủ yếu để làm thực phẩm. Hạt và các bộ phận khác của đậu Nho nhe
cũng được sử dụng làm thức ăn cho gia súc.
Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata, thuộc chi Vigna, họ
Fabaceae, bộ Fabales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta.
Công thức hoa chung của họ đậu là: ↑ K5C5A10-8-7G1
1.1.2. Đặc điểm hình thái của đậu Nho nhe
Đậu Nho nhe là cây thuộc họ đậu có tuổi thọ ngắn (cây một năm), được trồng

20,34-22,97% [28]. Năm 2002, Khabiruddin và đồng tác giả đã phân tích các loài đậu
khác nhau thể hiện đặc điểm hóa sinh khác nhau. Sự thay đổi hàm lượng protein tổng
số trong hạt chín khô của đậu Nho nhe thay đổi từ 15,83-19,01% [17]. Sadana và
đồng tác giả (2006) đã xác định 14 mẫu đậu Nho nhe và chỉ ra hàm lượng protein
tổng số giao động từ 17,33-19,92% [24]. Các dữ liệu về năng suất, chất lượng và giá
trị bổ sung của các giống đậu Nho nhe đã được Raiger và đồng tác giả (2010) nghiên
cứu. Hàm lượng protein tổng số trong các giống đậu Nho nhe được trồng tại các địa
điểm khác nhau ở Ấn Độ đạt từ 17,52-21,02% [22]. Trong khi, Katoch (2011) đã xác
định 30 dòng đậu Nho nhe liên quan tới các đặc tính sinh lý và dinh dưỡng; đã chỉ ra
hàm lượng protein thay đổi từ 16,14-19,13% [16]. Như vậy, hàm lượng protein trong
hạt đậu Nho nhe giữa các giống là khác nhau.
Chất béo tổng số: Thực phẩm thuộc cây họ đậu gồm đậu Nho nhe có chứa một
lượng lớn chất béo không nhìn thấy. Tuy nhiên, thông tin thích hợp liên quan đến sự
thay đổi thông số này đã được xem xét trên quan điểm chế độ ăn giống nhau. Năm
1991, Gopalan và đồng tác giả đã báo cáo về giá trị chất béo tổng số dao động từ
0,14-5,63% ở các mức tiêu thụ thông thường ngoại trừ đậu tương. Trong khi hàm
lượng chất béo trong các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 3,46-4,03% [12].
Srivastava và đồng tác giả (2001) đã phân tích 17 mẫu đậu Nho nhe và xác định
hàm lượng chất béo dao động từ 1,97-3,73% [28]. Trong khi, báo cáo về hàm
lượng chất béo của Sharma (2002) là 0,83% [27]. Năm 2011, Katoch đã phân

4


tích 30 mẫu đậu Nho nhe và xác định hàm lượng chất béo của đậu Nho nhe ở vụ
mùa dao động từ 0,57-2,13% [16].
Chất xơ tổng số: Negi và đồng tác giả (2001) [20], Srivastava và đồng tác giả
(2001) [28] đã nghiên cứu các thông số hóa sinh trong các giống đậu Nho nhe
khác nhau chỉ ra giá trị của các tham số này giao động lần lượt từ 3,87-4,48% và
3,2-4,43%. Năm 2006, Sadana và đồng tác giả đã đánh giá 14 mẫu đậu Nho nhe

[17]. Saharan (2002) đã nghiên cứu các thông số lý hóa của các giống đậu tằm và đậu
Nho nhe có năng suất cao. Nghiên cứu chỉ ra sự thay đổi hàm lượng polyphenol dao
động từ 750-1698 mg/100g [25]. Priya (2005) đã xác định được tannin đặc có trong
30 giống đậu Nho nhe. Hàm lượng tannin đặc được xác định từ 26-105 mg/100g. Dữ
liệu được trình bày trong báo cáo thường niên của AICRN về các loại cây trồng đến
năm 2010 nhận thấy, hàm lượng tannin tổng số trong các giống đậu Nho nhe dao
động từ 510-625 mg/100g [21].
Hàm lượng khoáng: Trong hạt đậu Nho nhe có chứa một số nguyên tố khoáng
như canxi, sắt, kẽm. Hàm lượng của các nguyên tố khoáng này phụ thuộc vào từng
giống đậu Nho nhe khác nhau. Sadana và đồng tác giả (2006) xác định hàm lượng
canxi và kẽm có trong hạt đậu Nho nhe lần lượt đạt từ 0,27-0,35% và 2,19-3,39
mg/100g [24]. Năm 2010, Raiger và đồng tác giả đã xác định được hàm lượng canxi,
sắt và kẽm trong các giống đậu tương khác nhau trồng tại Ấn Độ lần lượt đạt từ 307379; 3,87-8,95 và 2,55-4,30 mg/100g [22].
1.1.4. Giá trị sử dụng của đậu Nho nhe
Các loài cây họ đậu là nguồn cung cấp protein rẻ, giàu dinh dưỡng và chất
lượng cao; có thể được thay thế cho protein động vật. Các loài cây họ đậu cũng tạo ra
các chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng như dược phẩm, chất dinh dưỡng và các sản
phẩm phụ thân thiện với sinh thái như tannin, nướu, thuốc sát trùng, nhựa, véc ni,
sơn, thuốc nhuộm và dầu diesel sinh học. Ngoài ra, các loài cây họ đậu còn được sử
dụng làm thức ăn cho động vật. Các loài cây họ đậu còn góp phần phát triển nền nông
nghiệp bền vững: chúng làm giàu nitơ trong đất thông qua các vi khuẩn cộng sinh và
đóng vai trò quan trọng trong quá trình xen canh giữa cây ngũ cốc và cây rau [29].
Ở nước ta, đậu Nho nhe thường được trồng nhiều trên các nương ngô, trên đất
đồi núi thổ canh, trồng xen canh gối vụ với ngô nương. Có khi cũng được trồng cho
leo lên hàng rào quanh nhà, từ vùng đồng bằng tới vùng núi có độ cao 1500m. Cây
mọc nhanh, tái sinh khỏe, có khả năng chịu khô hạn. Hạt đậu Nho nhe khô chứa
13,3% hàm lượng nước; 0,9% protein; 64,9% gluxit; 4,8% chất xơ; 4,2% tro. 100g

6


hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã

7


vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối
quan hệ di truyền giữa các loài.
Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của
sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau.
Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức năng,
nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã. Cấu trúc vùng ITS
gồm ITS1-5,8S-ITS2. Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và
nhanh chóng phân hủy. Lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và
ITS2) được nối với nhau qua locus 5,8S. Vùng 5,8S khá bảo thủ, trên thực tế có đủ tín
hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành. Do đó các locus 5,8S có thể phục vụ
như là một điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và
nhận diện. Tiện ích của vùng bảo thủ như 5,8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ
liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [27].
Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây
thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys
(UUU) của lục lạp. Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen
trnK và chưa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng
cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong
lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực
vật [27].
Việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là hướng nghiên cứu mới. Nhận
thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch DNA, ở
Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầu tiếp cận và quan
tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã
vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật,...) phục vụ

matK chia 52 loài thành 6 nhóm: nhóm I (gồm các loài và dưới loài của V.
friesiorum), nhóm II (các loài của V. membranacea), nhóm III (loài V. schimperi),
nhóm IV (các loài V. unguiculata, V. radiate, V. lobatifolia, V. angivensis, V.
vexillata), nhóm V (gồm các loài V. hosei, V. racemose, V. fischeri, V. oblongifolia,
V. marina, V. luteola) và nhóm VI gồm những loài còn lại [23].
Chen và đồng tác giả (2016) đã sử dụng chỉ thị maker SSR để xác định các loài
đậu Nho nhe Vigna umbellata L. Trong nghiên cứu này, khoảng 26 triệu trình tự
cDNA từ các loài đậu Nho nhe đã được xác định và được lắp ráp thành 71929 trình tự
có chiều dài trung bình khoảng 986 bp. Trong số các trình tự này có 38840 trình tự có

9


sự tương đồng protein và trình tự nucleotit với các trình tự trên NCBI; 3018 trình tự
đã được xác định là chỉ thị SSR tiềm năng trong phân loại các loài V. umbellate [10].
Năm 2004, Ba và đồng tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD để xác định 26 giống đậu
nho nhe (5 giống thuần chủng và 21 giống địa phương) từ Tây, Đông và Nam Phi. 28
cặp mồi được sử dụng để nhân dòng cho 202 băng; trong đó có 180 băng thể hiện sự
đa hình giữa các giống thuần chủng/181 giống địa phương. Kết quả chứng minh được
các giống địa phương có sự đa dạng hơn so với các giống thuần chủng [9].
Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng
chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn và
quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.
1.3. Tình hình nghiên cứu về nhóm cây họ đậu
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trên nhóm cây họ Đậu dựa trên trình tự
gen ITS như nghiên cứu của Krishna và đồng tác giả (2015) trên các giống đậu tương
về hệ thống phát sinh loài và các mối quan hệ hệ gen dựa trên vùng gen ITS của
rDNA. Các mối quan hệ phát sinh loài trong tất cả 18 loài thuộc giống đậu tương
Glycine được suy ra từ trình tự nucleotide biến đổi trong vùng đệm (ITS) của rDNA.
Hệ số phân ly dao động từ 0,2% (một nucleotide đơn) giữa loài Glycine max và

nhập nội dựa trên chỉ thị hình thái (đặc điểm thực vật học, nông sinh học) và chỉ thị
phân tử SSR. Kết quả phân tích đa dạng di truyền dựa trên 16 chỉ thị hình thái đã
phân chia các mẫu giống đậu cô ve thành 7 nhóm với hệ số tương đồng là 0,17. Sử
dụng 20 chỉ thị SSR, kết quả phân tích PCR trên các mẫu giống của nghiên cứu, chỉ
có 15 chỉ thị xuất hiện băng DNA đa hình và 5 chỉ thị không xuất hiện băng DNA là:
BM188, BMd-1, GATS91, C33 và C106. Kết quả thu được tổng số 69 allen đa hình,
trong đó chỉ thị BM152 có hệ số đa dạng cao nhất là 0,73. Dựa trên kết quả phân tích
ma trận đồng hình, các mẫu giống đậu cô ve có hệ số tương đồng di truyền dao động
từ 0,57-1. Kết quả chứng tỏ các mẫu giống đậu cô ve thu thập có sự đa dạng cao về
mặt di truyền. Nếu mức tương đồng di truyền là 0,69 có thể chia 60 mẫu giống thành
4 nhóm di truyền. Kết quả của nghiên cứu thể hiện khả năng ứng dụng cao của chỉ thị
SSR trong phân tích đa dạng di truyền đối với nguồn gen đậu cô ve. Phân tích đa
dạng 60 mẫu giống làm cơ sở lựa chọn mẫu giống cho chương trình chọn giống đậu
cô ve cho các mục đích khác nhau [4].
Năm 2007, Nguyễn Thị Lang đã sử dụng 30 giống đậu nành từ ngân hàng gen
của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu và đánh giá đa dạng nguồn
gen. Dùng hai loại chỉ thị phân tử (chỉ thị RAPD và SSR), được thiết lập giữa các

11


alen của SSR và của RAPD khoảng cách di truyền của RAPD lớn hơn so với phương
pháp của SSR. Điều này cũng ghi nhận bằng các tần suất alen có tương quan giữa các
giống của RAPD rất cao (r = 0,64-0,98). Sự tương quan giữa các locus lớn nhất là
OMDN109 và OMDN87, và tương quan giữa các locus nhỏ nhất là OMDN1 và
giống OMDN36. Sự tương quan giữa các giống trong phương pháp SSR chỉ thị biến
động (r = 0,42-0,97). Các giống có chỉ số alen giữa các locus cao đó là OMDN118 và
OMDN34. Tương quan giữa các locus nhỏ nhất là OMDN113 và OMDN31. Thông
qua các dữ liệu chỉ thị RAPD với 9 mồi được sử dụng cho 30 giống phân thành 4
nhóm chính. Trong phân nhóm của SSR trên 6 chỉ thị được ghi nhận với 3 nhóm khác

hóa sinh trên đối tượng đậu Nho nhe ở Việt Nam chưa có.

13


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
Mẫu đậu Nho nhe nghiên cứu thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu được sử dụng để
tiến hành nghiên cứu các đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và di truyền.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết và được cung cấp bởi
các hãng khác nhau được liệt kê ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất

Hãng sản xuất

Acrylamide, chloroform, isoamyl alcohol, EDTA

Invitrogen

Mồi

Invitrogen

Đệm, Taq DNA polymelase

Invitrogen



Máy chuẩn pH tự động

Thụy Sỹ

Máy li tâm lạnh Eppendof 524

Đức

Máy quang phổ UV-1800

Nhật Bản

Nồi khử trùng

Nhật Bản

Máy PCR

Đức

Máy soi gel

Mỹ

Máy điện di

Anh

La men, lam kính, pipet, ống eppendof

Bước 2: Lát cắt được rửa sạch javen bằng nước cất.
Bước 3: Ngâm mẫu bằng dung dịch axit axetic để tẩy sạch hết javen còn dính lại
trên lát cắt.
Bước 4: Rửa sạch mẫu bằng nước cất (2 lần).
Bước 5: Nhuộm đỏ mẫu bằng dung dịch carmine trong khoảng 25-30 phút.
Bước 6: Rửa mẫu trong nước cất.
Bước 7: Nhuộm mẫu trong dung dịch xanh metylen loãng khoảng 20 giây.
Bước 8: Rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Bước 9: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật và đậy lamen. Quan sát lát
cắt trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 4-10 lần để thu kết quả.
2.2.3. Xác định hoạt tính α-amylase
Hạt mầm đậu Nho nhe bóc vỏ, cân khoảng 2g nghiền trong cối sứ và bổ sung 1,8
ml dung dịch đệm photphat citrate pH = 6,8; lắc đều và để 5-10 phút rồi ly tâm 12000
vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu dịch trong (dịch enzyme).
Hoạt tính α-amylase được định lượng bằng cách đo hàm lượng đường glucose
giải phóng khi thủy phân tinh bột bởi enzyme theo phương pháp của Miller (1959)
[19]. Lượng đường giải phóng được xác định bằng cách đo độ hấp phụ ở 540 nm, dựa
vào cường độ màu tạo phức với thuốc thử. Tiến hành đo như sau:
Ống thí nghiệm: 0,5 ml tinh bột 1,0% pha trong 20 mM đệm photphat pH 6,0
được cho vào ống nghiệm sau đó thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và

16