ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA
--------

TRẦN THỊ ĐỨC Ý

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN
HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT
N-HEXANE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU
HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA
--------

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN
HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC DỊCH CHIẾT
N-HEXANE LÁ ĐU ĐỦ ĐỰC (CARICA PAPAYA L.) THU
HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC

Sinh viên thực hiện



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1.Tính cấp thiết của đề tài ...........................................................................................1
2.Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................2
3.Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................2
4.Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................................2
4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết ......................................................................2
4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm ................................................................3
5.Bố cục của khóa luận tốt nghiệp ..............................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. Giới thiệu về cây Đu đủ .......................................................................................4
1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ trong nƣớc ........................6
1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ ngoài nƣớc..............................6
1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ ........................................9
1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ....................................15
1.5.1. Phƣơng pháp MTT ..........................................................................................15
1.5.2. Phƣơng pháp SRB ...........................................................................................15
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................17
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu.........................................................17
2.1.1. Nguyên liệu .....................................................................................................17
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu.......................................................................17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................18
2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý.......................................................................18
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá
Đu đủ đực ..................................................................................................................19
2.2.2.1. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật ..................................................................19
2.2.2.2. Phƣơng pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất ..........................20
2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực ................................................20
2.2.3.1. Alkaloid ........................................................................................................20

3.2.1.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi n-hexane .......33


3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi n-hexane ................36
3.2.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phƣơng pháp chiết siêu âm .......36
3.2.3.1. Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi n-hexane ............36
3.3. Kết quả định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực ............................................38
3.4. Kết quả điều chế cao chiết .................................................................................40
3.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane từ lá Đu đủ đực ......................40
3.6. Kết quả khảo sát thành phần hóa học dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực bằng
phƣơng pháp GC-MS ................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................45
1. Kết luận .................................................................................................................45
2. Kiến nghị ...............................................................................................................46
TÀI LIỆU TH M KHẢO .........................................................................................47
Tiếng Việt ..................................................................................................................47
Tiếng Anh ..................................................................................................................48


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BuOH: Butanol
CHCl3: Chloroform
EtOAc: Ethyl acetate
MeOH: Methanol
GC-MS: Gas chromatography-Mass spectrometry
SRB: Sulforhodamine B
DMSO: Dimethyl sunfoxide




30

3.2

Kết quả khảo sát hàm lƣợng tro trong lá Đu đủ đực

30

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại trong lá Đu đủ
đực
Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi
n-hexane
Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng chiết ngâm dầm trong
dung môi n-hexane
Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi nhexane


3.12

Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane lá Đu đủ
đực

42


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1

Hình ảnh Đu đủ

5

1.2

Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ

8

chiết soxhlet
Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao n-hexane theo thời gian
chiết siêu âm
Mối quan hệ giữa khối lƣợng cao chiết n-hexane theo nhiệt
độ chiết siêu âm
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực

32

34

35

36

38

41


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Xã hội phát triển kéo theo nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều. Hiện
nay, y học hiện đại đã có nhiều phƣơng pháp điều trị bệnh với hiệu quả điều trị cao.
Tuy nhiên, điều trị bằng thuốc trong thời gian dài có thể gây ảnh hƣởng xấu đến sức
khỏe của ngƣời bệnh và là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh khác. Do đó, việc sử
dụng các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên an toàn hơn, không phải chịu các
tác dụng hay độc tố từ các chất hóa học ngày càng đƣợc ƣa chuộng.
Ở Việt Nam, cây Đu đủ đƣợc trồng rất nhiều, diện tích trồng Đu đủ cả nƣớc
ƣớc khoảng 10000-17000 hecta với sản lƣợng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [9].

dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực (Carica papaya L.), góp phần cung cấp các thông
tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hóa học của ch ng, nâng cao giá trị sử dụng
của loài thực vật này trong thực tiễn.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
-

Lá Đu đủ đực đƣợc thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng.

-

Xác định chỉ số hóa lý.

-

Chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực trong dung môi n-hexane bằng 3 phƣơng

pháp: ngâm dầm, soxhlet, siêu âm để lựa chọn phƣơng pháp chiết tối ƣu. Từ dịch
chiết thu đƣợc bằng phƣơng pháp chiết soxhlet, tiến hành định danh các hợp chất
hoá học ở quy mô phòng thí nghiệm.
-

Tiến hành chiết phân đoạn lần lƣợt với các dung môi: methanol, n-hexane,

chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch
chiết n-hexane trên 3 dòng tế bào ung thƣ phổi, ung thƣ gan, ung thƣ v .
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu

thu ết



siêu âm;
-

Phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC - MS)

-

Các phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào;

-

Các phƣơng pháp xử lý số liệu bằng toán học.

5. Bố cục của khóa luận tốt nghiệp
Khóa luận tốt nghiệp gồm 50 trang; 12 bảng; 6 hình,ảnh và 36 tài liệu tham
khảo. Với:
Phần mở đầu (3 trang)
Chƣơng 1 – Tổng quan tài liệu (13 trang)
Chƣơng 2 – Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (13 trang)
Chƣơng 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang)
Kết luận và kiến nghị (2 trang)
Tài liệu tham khảo (4 trang)

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ
Đu đủ (Carica Papaya L.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae). Nguồn gốc Châu

Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung

bình, sinh trƣởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lƣợng tốt, năng
suất cao. Là giống yêu cầu nhiệt cao nên đƣợc trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.

4


-

Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung

Quốc. Cây thấp, sinh trƣởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt
quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy
sâu, phiến lá dày.
-

Giống Đu đủ Thái Lan: là giống đƣợc nhập trồng trong thời gian gần đây.

Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lƣợng tốt. Tuy nhiên giống
này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá.
-

Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới đƣợc nhập trồng trong thời gian gần

đây. Cây thấp, sinh trƣởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg
quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo
quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9].

A: hoa cái

lập từ lá Đu đủ [3].
Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá
Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc,
buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập đƣợc 6 hợp chất: danielone, carpainone,
acid pluchoic, apocynol

, carpaine, pseudocarpaine. Trong đó carpainone là hợp

chất mới và 2 chất danielone và apocynol

lần đầu tiên đƣợc phân lập từ lá Đu đủ

[4].
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI
NƢỚC
Trên thế giới, năm 1965, Govindachari T.R., Nagarajan K. và Viswanathan
N. đã xác định đƣợc cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alcaloid đƣợc phân
lập từ lá Đu đủ 30].
Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập đƣợc 2 alcaloid piperideine là
dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31].
Năm 2002, David S. và cộng sự đã xác định đƣợc glycoside là prunasin và
sambunigrin trong lá và thân Đu đủ [28].

6


Năm 2007,

ntonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol



Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol

Carpaine

Pseudocarpaine

Dehydrocarpaine I

Dehydrocarpaine II

Kaempferol

Acid protocatechuic

H nh 1.2. Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ
8


Bảng 1.1. Thành phần hóa học lá Đu đủ
Nhóm chất

Thành phần hóa học

Phenolic,

5,7-dimetthoxy coumarin,

xit Protocatechui,


1.4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ
Các phƣơng pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dƣợc lý của thực vật
đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 26, 34]. Hoạt tính sinh học của lá Đu
đủ đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc và trên thế giới công bố khá phong phú.
 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ
có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và
Staphylococcus aureus [1].
Năm 2011, Rahman S. và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol 95% của lá
đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dƣơng tại nồng độ 5
và 10 mg/mL. Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của lá 1250-5000 μg/L
[29].
Năm 2012, Moses

lo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng

nƣớc lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17].
9


Năm 2015, K. Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của
lá Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Kết quả
cho thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dƣơng:
Staphylococcus aureus và Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm:
Escherichia coli, Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella
paratyphi, Vibro chloreae [23].
Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác
dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực.
 Tác dụng trị u bƣớu, ung thƣ

dòng tế bào ung thƣ ngƣời: ung thƣ biểu mô KB, ung thƣ máu HL-60, ung thƣ phổi
LU-1, ung thƣ v MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [4].
Các nghiên cứu ở điều kiện in vitro về việc dùng lá Đu đủ để ức chế, tiêu
diệt tế bào ung thƣ đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.2:
Bảng 1.2. Tác dụng của chất chiết từ lá Đu đủ lên các dòng tế bào ung thƣ khác
nhau trong điều kiện in vitro
Dòng tế bào ung thƣ
Tế bào ung thƣ v T47D

Phƣơng pháp xử lý
Phân

mảnh

Kết quả

protein - Các phân mảnh protein gây

RIPS phân lập từ lá

độc tế bào (IC50 = 2,8
µg/mL)
- Kích thích quá trình tự chết
với biểu hiện của p53 (tăng
59,4%)

và

BCl-2


Đu

đủ

(0,625-20 dòng tế bào khối u rắn và tế

11


- Tế bào lymphoma

mg/mL)

bào tạo máu

- Bệnh bạch cầu mãn tính

Dịch chiết nƣớc lá Đu đủ

- Ung thƣ gan Hep G2

làm giảm cytokine IL-2 và

- Ung thƣ phổi PC 14

IL-4, trong khi đó lại làm
tăng cytokine Th1 nhƣ là IL-

- Ung thƣ tuyến tụy



- Ung thƣ máu HL-60

Carpaine

- Ung thƣ phổi LU-1

Pseudocarpaine

phân của tế bào ung thƣ biểu mô

lập từ lá Đu đủ

(IC50 lần lƣợt tƣơng ứng 1,13

- Ung thƣ vú MCF-7

tinh

khiết Carpaine và Pseudocarpaine
và ức chế đáng kể sự phát triển

và 1,66 µg/mL), tế bào ung
thƣ máu (IC50 lần lƣợt tƣơng
ứng 2,94 và 3,49 µg/mL), tế
bào ung thƣ phổi (IC50 lần
lƣợt tƣơng ứng 1,29 và 2,17
µg/mL) và tế bào ung thƣ v
(IC50 lần lƣợt tƣơng ứng 1,34
và 2,43 µg/mL)

chu kỳ phân bào
Acid Caffeic: 0,25 mg/g

- Ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn

Kaempferol: 0,03 mg/g

- Cảm ứng quá trình tự chết

Quercetin: 0,04 mg/g

- Ức chế sự truyền tín hiệu
- Ngăn chặn sự hình thành mạch máu
trong khối u.
Nhóm chất: Alcaloid
Nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế
các tế bào ung thƣ:
- Ung thƣ biểu mô KB

Carpaine

- Ung thƣ máu HL-60

Pseudocarpaine

- Ung thƣ phổi LU-1
- Ung thƣ v MCF-7

Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong lá Đu đủ cái có nhiều
hợp chất có hoạt tính chống ung thư.

 Công dụng trong dân gian

14


Lá Đu đủ đƣợc sử dụng làm mềm thịt khi nấu.
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thử theo phƣơng pháp của Scudiero D.A. và
cộng sự [27]. Đây là phƣơng pháp thử độ độc tế bào in vitro đƣợc viện Ung thƣ
Quốc gia (NIC) Maryland, Hoa Kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn, nhằm
sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung
thƣ ở điều kiện in vitro.
Trong những năm gần đây, một số phƣơng pháp so màu nhanh đã đƣợc miêu
tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thƣ ở mức độ in vitro, hiện nay hai
phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng là: phƣơng pháp MTT và phƣơng pháp SRB.
Trong đó, phƣơng pháp tetrazolium (MTT) đƣợc sử dụng phổ biến.
1.5.1. Phƣơng pháp MTT
Phƣơng pháp này lần đầu tiên đƣợc miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [9]. Theo tác giả, muối tetrazolium đƣợc dùng để
triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển
của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể
của tế bào hoạt động, dƣới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT
biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính
xác cao. Phƣơng pháp đƣợc dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát
triển và hoạt động của tế bào.

Formaran (màu tím)

Tetrazolium (màu vàng)
1.5.2. Phƣơng pháp SRB