B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TH QUNH

SàNG LọC Họ VI KHUẩN ĐƯờNG RUộT KHáNG
CARBAPENEM, ENTEROCOCCUS KHáNG
VANCOMYCIN Và VI KHUẩN SINH ESBL
Từ CáC BệNH PHẩM LÂM SàNG TạI KHOA HồI SứC
TíCH CựC,
BệNH VIệN BệNH NHIệT ĐớI TRUNG ƯƠNG NĂM 2017

CNG LUN VN THC S Y HC


H NI 2017
B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TH QUNH

SàNG LọC Họ VI KHUẩN ĐƯờNG RUộT KHáNG
CARBAPENEM, ENTEROCOCCUS KHáNG
VANCOMYCIN Và VI KHUẩN SINH ESBL
Từ CáC BệNH PHẩM LÂM SàNG TạI KHOA HồI SứC


Klebsiella Pneumoniae carbapenemase

NDM1

New Delhi Metallo-beta-lactamase-1

NKBV

Nhiễm khuẩn bệnh viện

OXA

Oxacillin

VRE

Vancomycin-resistant Enteroccus


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
Chương 1.................................................................................................................. 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................3
1.1. Họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)...................................................................3
1.1.1. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)...................................................................3
1.1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem [14][15].............................................................................3
1.1.3. Cơ chế đề kháng carbapenem của họ vi khuẩn đường ruột..............................................3
1.2. Enterococcus kháng vancomycin (VRE)......................................................................................5

2.10.1. Thời điểm bệnh nhân mới nhập viện:.............................................................................19
2.10.2. Thời điểm bệnh nhân đã điều trị tại khoa Điều trị tích cực:..........................................19
2.10.3. Thời điểm bệnh nhân ra viện..........................................................................................19
2.11. Quy trình xét nghiệm..............................................................................................................20
2.11.1. Nuôi cấy............................................................................................................................20
2.11.2. Định danh.........................................................................................................................21

Chương 3................................................................................................................ 21
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................................21
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.............................................................................22
3.1.1. Tỷ lệ bệnh phẩm dương tính và âm tính khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc............22
3.1.2. Tỷ lệ dương tính khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc theo loại bệnh phẩm...............22
3.2. Sàng lọc tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trên các môi trường...............................................22
3.2.1. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar CARBA......22
3.2.2. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar VRE...........23
3.2.3. Sàng lọc tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trên môi trường CHROMagar ESBL..........24
3.2.4. Sàng lọc vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp theo loại bệnh phẩm..........................24


Chương 4................................................................................................................ 24
DỰ KIẾN BÀN LUẬN..........................................................................................24
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..........................................................................................25
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ.........................................................................................25
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn kháng kháng sinh.......................................................20
Bảng 2.2: Khuẩn lạc bắt màu trên môi trường CHROMagarTM CARBA.................................20
Bảng 2.3: Khuẩn lạc bắt màu trên môi trường CHROMagarTM VRE.....................................21

hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Ước tính có khoảng 700000
bệnh nhân tử vong/năm trên thế giới do tình trạng kháng kháng sinh gây. Con số
này được dự báo sẽ tiếp tục tăng lên đến 100 triệu ca tử vong vào năm 2050 Tình
trạng đề kháng kháng sinh tiếp tục gia tăng trên toàn cầu. Các chủng kháng thuốc,
đặc biệt là đa kháng gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã đặt ra nhiều thách thức đối với
nhà lâm sàng do thiếu các kháng sinh điều trị có hiệu quả. Điều này đang thực sự
diễn ra tại nhiều bệnh viện, trong các khoa hồi sức tích cực tại các nước thu nhập
thấp và trung bình nơi mà một số bệnh nhiễm khuẩn không thể điều trị được [2].
Một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Acinobacteria baumannii đã kháng lại hầu hết các loại kháng sinh bao
gồm cả các kháng sinh phổ rộng hiện nay như cephalosporin và carbapenem Các
kháng sinh “thế hệ một” gần như không được lựa chọn trong nhiều trường hợp. Các
kháng sinh thế hệ mới, đắt tiền, thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng cũng đang mất dần
hiệu lực.
Tỷ lệ các chủng E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp. … sinh men betalactamase phổ rộng (ESBL - extended-spectrum beta-lactamases) đã vượt quá 50%.
Như vậy, chỉ còn nhóm kháng sinh cuối cùng là carbapenem như imipenem,
meropenem và doripenem được sử dụng để diều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn
Gram âm [6]. Người ta đã tìm thấy chủng Klebsiella pneumoniae sinh enzyme KPC
và Escherichia coli sinh NDM1 phá huỷ carbapenem và lan truyền các gene đề
kháng cho các vi khuẩn khác. Hơn nữa, các chủng enterococcus spp. giảm nhạy
cảm với vancomycin và Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii sinh
ESBL gây khó khăn trong lựa chọn kháng sinh điều trị [7].
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về các loại vi khuẩn kháng vancomycin,
carbapenem và vi khuẩn sinh ESBL. Đây là các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện.
Nhiều nghiên cứu cho thấy NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện,


2

tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và chi phí điều trị [1][2]. Tại

1.1. Họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)
1.1.1. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)
Enterobacteriaceae là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
ngộ, không có men oxidase, lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không), khử
nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhưng nếu di động thì có nhiều lông
xung quanh thân, không sinh nha bào. Các tác nhân kháng kháng sinh thế hệ mới
thường được đề cập đến gồm Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp.,
Enterobacter spp., Serratia spp. [13].
1.1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem [14][15]
Carbapenem là kháng sinh nhóm beta lactam có phổ tác dụng rộng nhất, tác
động đến quá trình sinh tổng hợp vách vi khuẩn. bao gồm: Meropenem, ImipenemCilastatin, Ertapenem, Doripenem.
Meropenem: phổ tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí, gram
âm hiếu khí sinh ESBL( Extended Spectrum Beta Lactamase). Meropenem được
FDA chấp thuận điều trị nhiễm trùng ổ bụng, viêm màng não trẻ em > 3 tháng tuổi,
nhiễm trùng da/cấu trúc da biến chứng.
Imipenem- cilastatin: phổ tác dụng tương tự Meropenem
Ertapenem: phổ tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí. Nhưng
không giống với carbapenem khác, Ertapenem không tác dụng trên Pseudomonas
Aeruginosa. FDA chấp thuận điều trị viêm phổi cộng đồng, nhiễm trùng tiết niệu
biến chứng, nhiễm trùng khung chậu, nhiễm trùng da/cấu trúc da.
Doripenem: tác dụng trên vi khuẩn gram âm kỵ khí và hiếu khí.
1.1.3. Cơ chế đề kháng carbapenem của họ vi khuẩn đường ruột
Ngoài đề kháng tự nhiên, vi khuẩn còn có thể nhận được hoặc phát triển khả
năng đề kháng thuốc kháng sinh. Cơ chế kháng kháng sinh này được chia làm ba


4

nhóm chính: (i) làm giảm thiểu nồng độ kháng sinh trong nội bào bằng cách giảm
tính thấm của màng tế bào hoặc sử dụng các hệ thống bơm ngược; (ii) thay đổi các


Thay đổi đích tác động
Cách thay đổi các đích tác động của kháng sinh cũng là một phương tiện
hiệu quả trong đề kháng kháng sinh. Ngoài việc tạo đột biến trên gen mã hóa các
phân tử đích, phương thức bảo vệ các phân tử đích đã được tìm thấy có liên quan
đến đến cơ chế đề kháng của nhiều loại kháng sinh quan trọng. Ví dụ, khả năng
methyl hóa vị trí trước đây được cho là có liên quan đến đề kháng kháng sinh như
gen armA, mã hóa cho enzyme methyltransferase, tìm thấy ở các chủng
Enterobacteriaceae gây bệnh tại Bắc Mỹ, Châu Âu và Ấn Độ. Các gen rmt mã hóa
cho một methyltransferase khác, tìm thấy ở Bắc Mỹ, Trung và Nam Mỹ, và Ấn Độ
[21][22].
1.2. Enterococcus kháng vancomycin (VRE)
1.2.1. Enterococcus
Enterococcus là cầu khuẩn gram dương, hiếu kỵ khí tùy tiện, có trong hệ vi
khuẩn bình thường ở dạ dày ruột, gây bệnh cơ hội. Cho đến nay, khoảng 35 chủng
Enterococcus spp., nhiều nghiên cứu chỉ ra hai chủng gây bệnh chủ yếu và kháng
kháng sinh thế hệ mới là Enterococcus faecium và Enterococcus faeccalis [23].
1.2.2. Vancomycin
Vancomycin là kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế quá trình
sinh tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn, ở giai đoạn sớm hơn so với các kháng sinh nhóm
beta-lactam. Vancomycin còn tác động đến tính thấm của màng tế bào và quá trình
tổng hợp ARN của vi khuẩn. Chúng tác dụng trên hầu hết các vi khuẩn, với
Enterococcus, vancomycin không có hiệu lực cao như trên tụ cầu vàng kháng
methicillin MRSA, một số chủng Pseudomonas và các vi khuẩn không có lớp màng
peptidoglycan (Mycoplasma) [24].
1.2.3. Cơ chế đề kháng vancomycin của Enterococcus
Thay đổi đích tác động
Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng thường làm cho vi khuẩn
nhanh chóng đề kháng. Vào những năm 1980, đề kháng loại kháng sinh
glycopeptides này đã được ghi nhận lần đầu tiên, sự đề kháng này là hậu quả từ sản

Có hàng trăm biến thể của gen CTX-M (là gen mã hóa ESBL đóng vai trò
chính trong đề kháng cefotaxime cao hơn so với oxyimino-β- lactam). CTX-M14 và
CTX-M15 là những enzyme rất phổ biến trong các chủng vi khuẩn sinh ESBL, đặc
biệt là trong E. coli và K. pneumoniae đề kháng cephalosporin [29].


7

1.4. Các kỹ thuật phát hiện CRE, VRE và vi khuẩn sinh ESBL [30][31]
1.4.1. Kỹ thuật phát hiện họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem
Các kỹ thuật dùng để chẩn đoán hiện nay chủ yếu dựa trên cơ chế phát hiện
carbapenemase. Trong đó, một số kỹ thuật đang được áp dụng phổ biến gồm:
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
Kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuyếch tán kháng sinh trong đĩa thạch từ
khoanh giấy tẩm kháng sinh còn được gọi là kháng sinh đồ theo phương pháp
Kirby-Bauer.
Kháng sinh được tẩm lên khoanh giấy với một nồng độ quy định, đặt lên đĩa
thạch dinh dưỡng đã được cấy vi khuẩn. Trong quá trình ủ, kháng sinh từ khoanh
giấy khuyếch tán ra môi trường thạch và ức chế sự phát triển của vi khuẩn, vì thế
tạo một vòng không có vi khuẩn mọc (vòng vô khuẩn) xung quanh khoanh kháng
sinh. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được
đánh giá qua sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi kháng sinh đạt đến một
nồng độ nhất định. Đường kính vùng ức chế tỷ lệ thuận với mức độ nhạy cảm được
phiên giải ra các phân loại S (sensitive – nhạy cảm), I (intermediate – trung gian),
hoặc R (resistant – đề kháng) khi so sánh với bảng chuẩn CLSI cập nhật hàng năm.
Kỹ thuật Hodge
Sàng lọc các chủng sinh carbapenemase. Nếu chủng sản xuất carbapenemase
(dương tính) sẽ biểu hiện bằng các khuẩn lạc tạo hình nan quạt (do sự tăng sinh tại vùng
giao thoa giữa vệt cấy và chu vi vùng ức chế của chủng chỉ định E. coli ATCC 25922).
Chủng không sản xuất carbapenemase (âm tính) sẽ không biểu hiện sự tăng trưởng.

phương pháp đĩa đôi phát hiện sự cộng hưởng giữa một cephalosporin thế hệ thứ ba
và amoxicillin/clavulanic acid trên kháng sinh đồ, tạo nên vòng kháng khuẩn dạng
“nút chai champagne” trên các chủng sinh men ESBL.


9

Hình 1.2: Kết quả dương tính của kĩ thuật đĩa đôi
Kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
1.4.4. Môi trường nuôi cấy chọn lọc [32][33][34]
Trên thế giới hiện nay, có nhiều môi trường chọn lọc được phát triển để sàng
lọc trực tiếp các vi khuẩn kháng kháng sinh từ bệnh phẩn lâm sàng . Trong đó, các
đĩa thạch chọn lọc của CHROMagar.
• CHROMagarTM CARBA sử dụng cho sàng lọc họ vi khuẩn đường ruột
kháng Carbapenem với độ nhậy 85% trong khi nghiên cứu so sánh với các
môi trường khác có độ nhậy thấp hơn như CHROMAgar™-KPC (65%),
MacConkey (69%).
• CHROMagarTM VRE sử dụng cho sàng lọc Enterococci. Môi trường có độ
nhậy phát hiện vi khuẩn kháng vancomycin đạt 95.7% sau 24 giời nuôi cấy.
• CHROMagarTM ESBL có độ nhậy cao, phát hiện thấp < 100 CFU/ml.
1.5. Hệ thống định danh MALDITOP [35]
Là hệ thống định danh vi khuẩn tự động, tiên tiến, sử dụng công
nghệ MALDI-TOF (Matrix Assisted

Laser

Desorption

Ionization


chủng Escherichia coli và 10.8% chủng K. pneumoniae đã kháng lại carbapenem [41].
Ở châu Á, tỷ lệ họ vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem vẫn thấp trong thời
gian nghiên cứu 2000-2012 với tỷ lệ kháng trung bình 0,6% (0,6-0,8%, imipenem) và
0,9% (0,7-1,2%, meropenem). Tỷ lệ kháng thuốc đối với imipenem và meropenem
trong Enterobacteriaceae thể hiện xu hướng leo thang đáng kể, trong đó E. coli,
Klebsiella spp., Enterobacer spp. và Klebsiella spp. chiếm tỷ lệ lớn nhất. Mức độ
kháng kháng sinh imipenem trong Enterobacteriaceae trong giai đoạn 2000-2012 như
sau: Serratia spp. (1.8%), Proteus spp. (1.6%), Klebsiella spp. (0,8%), Citrobacter
spp. (0,8%), Enterobacer spp. (0.7%) và E. coli (0.2%) [42].
Enterococcus kháng vancomycin
Nhiễm khuẩn do Enterococcus đề kháng với vancomycin (VRE) gia tăng
nhanh chóng và trở thành mối quan tâm chủ yếu trong lâm sàng. VRE được nhắc


11

đến lần đầu tiên tại Hoa Kỳ vào năm 1989, chiếm dưới 1% các chủng
Enterococcus được phân lập nhưng là mối đe dọa nghiêm trọng trong những năm
gần đây, chiếm gần 30% trong số 66,000 trường hợp nhiễm Enterococcus có liên
quan đến chăm sóc y tế và 1,300 trường hợp tử vong hàng năm [43].
E. faecium chiếm đa số trong các chủng đề kháng với vancomycin (77%),
đề kháng với nhóm beta-lactam (ampicillin) và aminoglycosid, là hai trong số các
kháng sinh được dùng để điều trị Enterococcus. Ngược lại, Enterococcus
faecalis ít gặp hơn các chủng Phần lớn các chủng VRE được báo cáo ở Hoa Kỳ
là Enterococcus faecium có vanA. Tỷ lệ ở Hoa Kỳ cao hơn ở châu Âu rất nhiều,
kháng vancomycin là 72,4% ở E. faecium và 9,6% ở E. faecalis trong tổng số các
chủng trên thu thập được từ các bệnh phẩm lâm sàng [44].
Vi khuẩn sinh ESBL
Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae: được đánh giá là 2 trong số 3 tác
nhân gây nhiễm khuẩn đáng quan tâm nhất, có liên quan tới cả NKBV và nhiễm

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Acinotobacter baumanii,cho thấy tỷ
lệ đề kháng kháng sinh tương đối cao và có xu hướng gia tăng [9]. Nghiên cứu ở
Bệnh viện đa khoa Trung Ương Huế cho thấy tỷ lệ cấy máu dương tính với
Acinotobacter baumaniilà 19% và đề kháng với kháng sinh imipenem là 45%
[52].Nghiên cứu trong 2 năm 2010-2012 tại một bệnh viện ngoại khoa đầu ngành
của miền Bắccho thấy có 69 trong tổng số 4.096chủng Enterobacteriaceae phân lập
được đã kháng carbapenem. Điều đáng báo động hơn là 47 (68.1%) trong tổng số
69 chủng này có mang NDM-1 [53].
Họ vi khuẩn đường ruột kháng Carbapenem
Từ 5/2008 đến 11/2009 đã có 1602 chủng trực khuẩn Gram âm dễ mọc
được nghiên cứu từ 16 bệnh viện trên toàn quốc. Kết quả cho thấy
Enterobacteriaceae còn nhạy cảm rất cao với carbapenems [54]. Theo đánh giá
của CDDEP cho giai đoạn 2011-2014, Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ
Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem từ 20.1-49.9% [55] Nghiên cứu trong
2 năm 2010-2012 tại một bệnh viện ngoại khoa đầu ngành của miền Bắc cho thấy
có 69 trong tổng số 4.096 chủng Enterobacteriaceae phân lập được đã kháng
carbapenem. Điều đáng báo động hơn là 47 (68.1%) trong tổng số 69 chủng này
có mang NDM-1 [56].


13

Enterococcus kháng vancomycin
Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Một nghiên cứu tại
bệnh viện tỉnh Đồng Nai năm 2012 cho thấy tỷ lệ enterococcus kháng vancomycin
chiếm 16,7 %, trong đó, E. facecalis chiếm 55.84% [57].
Vi khuẩn sinh ESBL
Nghiên cứu từ 1328 trực khuẩn Gram âm hiếu khí năm 2012 có 388 trực
khuẩn có khả năng tiết ESBL thấy vi khuẩn thường gặp là Escherichia coli
(37,65%), Enterobacter (32,73%), Klebsiella (33,33%), Pseudomonas (16,18%),

- Phương pháp xử lý số liệu:
Sử dụng thuật toán thống kê y học (SPSS 22). Trong thống kê so sánh, sự khác biệt
được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 với các phép so sánh trung bình, tỷ lệ…
2.7. Đạo đức nghiên cứu
- Nghiên cứu được dựa trên ba nguyên tắc cơ bản của đạo đức là tôn trọng,
không gây hại và tạo sự công bằng cho tất cả bệnh nhân.
- Tất cả bệnh nhân đều được giải thích rõ về mục đích, nắm được trách nhiệm
và quyền lợi cụ thể của mình, tự nguyện tham gia nghiên cứu và có quyền rút khỏi
nghiên cứu bất cứu lúc nào.


15

2.8. Vật tư, trang thiết bị
Trang thiết bị
- Tăm bông,
- Ống đựng nước tiểu,
- Bẫy đờm.
- Túi bóng sạch
- Que cấy
- Đèn cồn
- Tủ an toàn sinh học
- Máy định danh MALDITOP và hóa chất định danh
Hóa chất sinh phẩm:
- Đĩa thạch CHROMagarTM CARBA
CHROMagarTM CARBA
Thạch
Thành phần

Đặc điểm


CHROMagarTM ESBL
Thạch
Thành phần

Đặc điểm
Thạch 15.0 g/L
Pepton và men 17.0 g/L
Hỗn hợp chromogenic 1.0 g/L

pH
Bảo quản

Chất bổ sung 0.57 g/L
7.0 ± 0.2
2-80C


17

Bệnh nhân nhập viện vào ICU

Lấy bệnh phẩm
Mủ vết thương
Đờm khạc hoặc đờm hút khí phế quản
Nước tiểu
Ngoáy trực tràng
Dán nhãn/ điền phiếu thu mẫu/ để BP trong tủ lạnh

Bệnh nhân xuất viện hoặc chuyển khỏi ICU không?